ВВЕДЕНИЕ 4
1 Обзор литературы 6
1.1 P. sibiricaкак объект исследования 6
1.1.1 Общая характеристика P. sibirica 6
1.1.2 Акселерация генеративного развития сосны сибирской 8
1.2 Зиготический эмбриогенез хвойных видов 10
1.3 Соматический эмбриогенез в культуре in vitro 14
1.4 Процесс и этапы соматического эмбриогенеза 19
1.4.2 Пролиферация 21
1.4.3 Созревание 21
1.4.4 Прорастание 22
1.5 Особенности соматического эмбриогенеза хвойных на примере Pinussibirica23
1.6 Роль состава питательной среды и условий культирования в процессе
индукции соматического эмбриогенеза 25
2 Объект и материалы исследования 29
2.1 Объект исследования 29
2.2 Материалы исследования 29
2.3 Процесс подготовки и стерилизации 29
2.4 Процесс приготовления питательных сред и введение эксплантов в
культуру in vitro 33
2.5. Цитологический анализ и статистическая обработка данных 37
3 Заключение и выводы 46
Список литературы 47
Актуальность. Хвойные деревья - неотъемлемая часть жизни человека и жизненно важный компонент лесного биоразнообразия. В частности, хвойные деревья являются возобновляемыми источники продуктов питания, кормов, дров, древесины и других ценных недревесных продуктов. Мировой спрос на древесину повышается каждый год и для того чтобы снизить нагрузку на существующие леса, необходимы глобальные усилия. Лесные плантации могут стать основным источником древесных материалов в ближайшем будущем. (Gupta. 2004; Malabadi R. et al. 2007c; Malabadi R. et al. 2008).
Сосна сибирская (Pinus sibirica Du Tour) - это ценная хвойная порода, произрастающая на территории России и имеющая широкий естественный ареал. Несмотря на широкую географию распространения, кедр сибирский кедр тяжело выращивать для промышленных лесосырьевых плантаций ввиду особенностей половой репродукции данного вида: семена кедровой сосны полиэмбриональны, и в одном только мегагаметофите может располагаться до шестнадцати зародышей. Такие полиэмбриональные семена требуют продолжительной стратификации, занимающей около полугода (Третьякова, 2017). В настоящее время вид также считается уязвимым вследствие лесных пожаров, антропогенного фактора, а также климатических изменений, происходящих во внешней среде.
Достижения в биотехнологии хвойных пород открывают новые возможности в области вегетативного размножения и генной инженерии. Разработка методов микроклонального размножения имеет множество потенциальных применений. В настоящее время многими учеными соматический эмбриогенез уже признается одним из наиболее перспективных направлений в области биотехнологии лесных видов деревьев (von Arnold et al., 2002, Klimaszewska 2007, Park 2013). Соматический эмбриогенез основан на тотипотентности соматических клеток растений - способности в полной мере реализовать генетическую информацию и давать начало целому организму.
Благодаря своей эффективности в регенерации растений соматический эмбриогенез стал незаменимым инструментом для ускорения развития разновидностей деревьев и их внедрения.
На данный момент в международной науке известны случаи успешного применения соматического эмбриогенеза и получения эмбриоидов более 30 видов рода Pinus.В нашей стране первые исследования данной проблемы и применения соматического эмбриогенеза к размножению хвойных пород начали проводить в Красноярском Институте леса, Сибирском отделении РАН (Третьякова, 2009).
В данной работе исследуется процесс инициации соматического эмбриогенеза сосны сибирской кедровой и влияние гормонов растительного происхождения на получение эмбриогенных каллусов в условиях in vitro. Следует отметить, что раннее подобные сравнения влияния гормонов в различных концентрациях на инициацию соматического эмбриогенеза в условиях культуры in vitro не проводилось.
Целью данной работы являлось получение эмбриогенных каллусов и изучение влияния гормонов ауксиновой и цитокининовой природы на инициацию и пролиферацию эмбриогенных культур P. Sibirica.
Задачи исследования:
1 Изучить процесс инициации и получения эмбриогенных культур из эксплантов различных генотипов.
2 Получить маркёры эмбриогенных каллусов на морфологическом и цитологическом уровнях.
3 Установить связь между концентрацией гормонов ауксиновой и цитокининовой природы и получением эмбриогенных каллусов
Соматический эмбриогенез является современной моделью исследования процессов дифференцировки и дедифференцировки растительных клеток, а также физиологических и молекулярно-генетических внутренних процессов (von Arnold et al., 2002). В настоящее время данный метод активно используется для получения и распространения генетически ценных особей деревьев, и повышения продуктивности лесов в результате насаждения полученных клоновых сеянцев, отличающихся улучшенным качеством древесины (Park, 2002; Pullman, 2010).
В проведенном исследовании был запущен процесс соматического эмбриогенеза сосны сибирской P.sibirica.Была исследована зависимость от концентрации гормонов растительного происхождения на процесс инициации соматического эмбриогенеза. Были получены каллусные культуры из зиготических зародышей деревьев №1-6. При этом формирование каллуса и индукция эмбриогенных культур были получены у эксплантов, собранных с деревьев №3 и 4.
По результатам проведенного исследования были сделаны следующие выводы:
1. Наиболее интенсивный рост каллусных культур был отмечен на среде DCR с применением гормона растительного происхождения альфа- нафтилуксусной кислоты и 6-бензиламинопурина в соотношении 2:1 и 4:2.
2. Наибольшей каллусной активностью обладали образцы семян с зиготическим зародышем находившихся на стадии инициации семядолей (3-3,5 мм.)
3. Индукция соматического эмбриогенеза зависит от дерева-донора. Рост каллусной массы наиболее активно шел у эксплантов двух деревьев (№3 и 4 из 7).
4. Удлиненные клетки неэмбриогенного каллуса способны сохраняться в культуре 9 мес. без субкультивирования.
