РЕФЕРАТ 2
ВВЕДЕНИЕ 4
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Са2+-регулируемые фотопротеины 7
1.2 Сходства и различия фотопротеинов ктенофор с фотопротеинами гидромедуз 8
1.3 Рекомбинантный фотопротеин беровин, особенности его строения и свойств 11
1.4 Формирование фотопротеинового комплекса на примере обелина и беровина 12
1.5 Особенности беровина 13
1.6 Свойства мутантов беровина 15
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 18
2.1. Получение экспрессионной конструкции pQE60-BAwt 18
2.2. Ненаправленный мутагенез на основе pQE60-BAwt 19
2.3 Скрининг на колониях с использованием экспрессионных штаммов E.coli 20
2.4 Сайт-направленный мутагенез и получение штаммов-продуцентов 20
2.5 Очистка апо-беровина 22
2.6 Очистка заряженного беровина 23
2.7 Измерение биолюминесцентной активности и константы спада биолюминесцентной реакции 23
2.8 Измерение спектров биолюминесценции и флуоресценции 24
2.9 Фото- и термо- инактивация 24
2.10 Приборы и реактивы 25
3 РЕЗУЛЬТАТЫ 26
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 44
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 46
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 47
Биолюминесценция - это испускание видимого света живыми организмами самостоятельно или за счёт симбионтов. Свечение вызвано окислением молекулы субстрата (люциферина) ферментом (люциферазой), в результате перехода оксилюциферина из возбужденного состояния в исходное [1]. Все океанические места обитания, мелкие и глубокие, пелагические и донные, включают биолюминесцентные виды [2].
Биолюминесцентные белки можно разделить на две группы: люциферазы, функционирующие как классический фермент, и фотопротеины, образующие в бескальциевых условиях устойчивый комплекс с
предокисленным субстратом. Ко второй группе относятся Ca2'-регулируемые фотопротеины медуз, такие как акворин и обелин, и фотопротеины гребневиков, например, беровин. Предполагается, что беровин, наряду с другими Ca2+-регулируемыми фотопротеинами гребневиков, относится к отдельному типу биолюминесцентных белков [3]. Отличительной особенностью биолюминесцентной реакции является то, что большая часть генерируемой энергии излучается в виде света, а не тепла. Поскольку свет с помощью современных регистрирующих приборов может быть измерен с высокой чувствительностью, методы с использованием биолюминесцентных белков в качестве репортерных молекул позволяют измерять вещества в аттомолярных концентрациях. В настоящее время реакции биолюминесценции широко используются в качестве аналитического инструмента. Например, Ca2+-регулируемый фотопротеин, акворин медузы Aequorea victoria,применяется для мониторинга внутриклеточного кальция, который регулирует многие биологические процессы [5]. При этом одной из аналитических задач является получение молекул с измененным спектром биолюминесценции. Таким образом, всестороннее исследование биолюминесцентных белков и, в частности, фотопротеинов гребневиков, является не только фундаментальной задачей, но и важной составляющей направления, развивающего применение этих белков в клеточной биологии, экспериментальной медицине и биотехнологии.
Беровин ктенофор Beroe abyssicolaявляется наиболее изученным фотопротеином гребневиков, поэтому он и был выбран в качестве объекта для эксперимента. Рекомбинантный апо-беровин получают путем экспрессии гена апо-белка в штаммах E.coliс последующей его очисткой и активацией in vitroв процессе инкубации с целентеразином при pH 9,0 и в присутствии 0,5 М NaCl без доступа света [5]. Активация же при стандартных физиологических внутриклеточных условиях является менее эффективной. Одним из методов, применяющихся для получения белков с измененными свойствами, является мутагенез, позволяющий создавать мутантные варианты белка с заданными параметрами. До конца не сформировано полное представление о строении субстрат-связывающей полости беровина. Поэтому важным аспектом в изучении этого белка является создание мутантов беровина с заменой аминокислот во внутренней полости белка и выявления их свойств. Также это позволяет определить роль аминокислот, принимающих участие в биолюминесценции. Кроме того, поскольку для возможности использования рекомбинантного беровина в качестве внутриклеточного репортера необходимо, чтобы формирование активного фотопротеинового комплекса происходило в физиологических условиях, важной задачей остается получение мутантов с подходящими для этого свойствами....
Рекомбинантные фотопротеины гребневиков наиболее эффективно образуют фотопротеиновый комплекс с целентеразином в щелочных условиях и при высокой концентрации соли, что препятствует их использованию в качестве репортерных молекул in vivo.Поэтому поиск мутантных вариантов рекомбинантного фотопротеина беровина, активирующихся при нейтральных значениях рН, важен как для понимания механизмов активации, так и для создания новых репортерных молекул для биоимиджинга.
В результате данной работы была разработана методика скрининга на колониях для анализа экспрессии и фолдинга фотопротеинов гребневиков и их мутантных вариантов в клетках E. coli XLlBlue.
С помощью ненаправленного мутагенеза были найден мутантный вариант беровина K90E, с оптимумом активации при условиях, близких к физиологическим, а также получена экспрессионная конструкция для получения апо-белка в неограниченных количествах в лабораторных условиях с помощью экспрессии его гена в бактериальной системе с использованием клеток E. coli.Мутант К90Е показал наибольший выход активного фотопротеинового комплекса при: pH 7,0 в присутствии 0,3 M NaCl. Фотопротеин гребневиков с такими характеристиками был получен впервые. Несмотря на то, что выход активного белка K90E и его удельная активность ниже, чем у беровина дикого типа, при определенной коррекции с помощью дополнительных мутаций или использования синтетических аналогов субстрата возможно получить белок с характеристиками, подходящими для аналитического применения.
Мутации E118V, S132P и E118V/S132P не показали ожидаемых результатов и имели условия активации как у беровина дикого типа.
Таким образом, замена аминокислотного остатка активного центра с положительным зарядом боковой цепи на другой с отрицательным зарядом может приводить к смене условий формирования фотопротеинового комплекса на близкие к внутриклеточным. Поиск и корректировка мутантных вариантов, способных активироваться в физиологических условиях, будет продолжен.
