Тип работы:
 Предмет:
 Язык работы:


Выделение и исследование ДНК бактерий

Работа №150976

Тип работы

Бакалаврская работа

Предмет

биология

Объем работы38
Год сдачи2020
Стоимость4235 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
61
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


ВВЕДЕНИЕ 4
1 Обзор литературы 6
1.1 ДНК 6
1.2 Генетическая система бактерий 7
1.3 Ген 16S рРНК 9
1.4 Клеточная стенка бактерий 10
1.5 Выделение ДНК лизисным методом 11
1.6 Полимеразная цепная реакция 12
1.7 Термостабильные ДНК-полимеразы 15
1.8 Электрофорез 15
1.9 Рестриктный анализ ДНК 18
1.10 Рестрикционный анализ амплифицированной рибосомальной ДНК
(метод ARDRA) 20
2 Материалы и методы 22
2.1 Используемые образцы биомассы почвенных бактерий 22
2.2 Методика посева микроорганизмов на агаризованную среду 22
2.3 Методика выделения ДНК 23
2.4 Методика проведения электрофореза 25
2.5 Методика проведения ПЦР 27
2.6 Проведение реакции рестрикции 28
2.7 Методика анализа in silico 28
3 Результаты 30
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 40
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 41
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 42

Бактерии остаются древнейшей группой организмов. Множество полезных и патогенных бактерий сопровождают человека на протяжении всей жизни и защищают наш организм от нежелательных внешних воздействий или, наоборот, являются возбудителями многих заболеваний. Они применяются в пищевой промышленности, в сельском хозяйстве, в медицине, при добыче полезных ископаемых и во многих других сферах жизни человека.
В последнее десятилетие, в результате широкого использования ПЦР и изучения ДНК, последовательность гена 16S рРНК играет ключевую роль в точной идентификации бактерий и открытии новых штаммов в микробиологических лабораториях. Идентификация бактерий
рестрикционным анализом амплифицированного гена рРНК остается актуальной для редких, медленно растущих и некультивируемых бактерий. Она не только дает представление об этиологии инфекционных заболеваний, но также помогает врачам в выборе антибиотиков и в определении продолжительности лечения и процедур инфекционного контроля. Поэтому анализ последовательности ДНК эволюционно-стабильных маркерных генов рассматривается в качестве генеральной стратегии изучения филогении и разнообразия бактерий [1].
Процедура выделения ДНК является важнейшим этапом в исследовании бактерий. От ДНК напрямую или через белки-ферменты зависят все процессы биосинтеза и катаболизм микроорганизмов. Поэтому необходимо научиться выделять достаточное количество исходного биологического материала для того, чтобы получить хорошую степень очистки ДНК, которая в дальнейшем может быть использована для ДНК- диагностики, ПЦР и многих других анализов.
Актуальность данной темы также обусловлена тем, что бактерии и продукты их жизнедеятельности применяются для создания: биопрепаратов для очистки почв, сточных вод от трудноразлагаемых веществ (нефть, нефтепродукты, тяжелые металлы, пестициды и пр.), противомикробных, противовирусных, противогрибковых препаратов, удобрений. Многие бактерии являются причиной различных заболеваний.
Цель данной работы:
Оптимизировать методику выделения ДНК из бактерий и использовать полученные образцы ДНК для дальнейшего рестрикционного анализа.
На основании поставленной цели были определены следующие задачи:
1) Оптимизировать процедуру выделения ДНК бактерий и использовать полученные образцы ДНК для получения ампликонов гена 16S рРНК;
2) Провести гель-электрофорез полученных ампликонов гена 16S рРНК с целью проверки их качества;
3) Провести рестрикцию полученных ампликонов и гель-электро форез полученных рестриктов с маркерами в агарозном геле для пополнения нашей базы данных электрофореграмм;
4) Задокументировать полученные результаты с помощью гель- документирующей системы.
5) Используя базу данных GenBank построить виртуальные электрофореграммы ряда видов бактерий и сравнить их с полученными экспериментально.
Работа выполнена на кафедре Медицинской биологии в Институте Фундаментальной Биологии и Биотехнологии СФУ.


Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

В данной работе я оптимизировала процедуру выделения ДНК из разных видов бактерий. Было подобрано оптимальное время инкубации с лизоцимом для грамотрицательных бактерий. Выяснила, что клеточную стенку грамположительных бактерий рода Bacillusразрушить сложнее в сравнении с другими грамположительными бактериями, что мы и можем увидеть по меньшей концентрации ДНК среди препаратов выделенной ДНК.
Использовала полученные образцы ДНК для получения ампликонов гена 16S рРНК и провела гель-электрофорез полученных ампликонов гена 16S рРНК с целью проверки их качества. Масса всех полученных ампликонов составила около 1500 п.о., что свидетельствовало об успешном проведении ПЦР.
Провела рестрикцию полученных ампликонов и гель-электрофорез полученных рестриктов с маркерами в агарозном геле для пополнения нашей базы данных экспериментальных электрофореграмм. Задокументировала полученные результаты с помощью гель-документирующей системы.
Таким образом были получены экспериментальные электрофореграммы следующих видов бактерий: Pantoea agglomerans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas kilonensis, Arthrobacter aurescens, Pseudomonas stutzeri, Exiguobacterium aurantiacum, Bacillus pumilus, Microbacterium phyllosphaerae, Bacillus atrophaeus, Bacillus cereus, Micrococcus luteus.
Используя базу данных GenBank, построила виртуальные электрофореграммы ряда видов бактерий и сравнила их с полученными экспериментально. Сравнение теоретических и практических электрофореграмм показало хорошее совпадение. Оно также позволило уточнить данные о видовом составе образцов почвенных бактерий, полученные ранее методом масс спектроскопии.



1. Woo, P.C.Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories / P.C.Y. Woo, S.K.P.Lau, J.L.L.Tengc, H.Tse, K.-Y.Yuen // Clinical Microbiology and Infection. - 2008. - V.14, I. 10. - P. 908-934.
2. Березов, T.T. Биологическая химия: учебное пособие / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин - Москва: Медицина, 2004. - 704 с.
3. Kaushik, M. A bouquet of DNA structures: Emerging diversity / M.Kaushik, S. Kaushik, K. Roy, A.Singh, S.Mahendru, M.Kumar, S.Chaudhary, S.Ahmed, S.Kukreti // Biochemistry and Biophysics Reports. - 2016. -V. 5. - P. 388-395.
4. Николаев, А. Я. Биологическая химия: учебное пособие / А. Я. Николаев. - Москва: Медицинское информационное агентство, 2007. - 589 с.
5. Spiegel, J. The Structure and Function of DNA G-Quadruplexes / J.Spiegel, S.Adhikari, S.Balasubramanian // Trends in Chemistry. - 2020. -V. 2, -I. 2. -P. 123-136.
6. Hagedorn, P.H. Locked nucleic acid: modality, diversity, and drug discovery / P.H.Hagedorn, R.Persson, E. D.Funder, N.Alb^k, S. L.Diemer, D.J.Hansen // Drug Discovery Today. -2020. -V. 23, -I. 1. -P. 101-114.
7. Dahm, R. Friedrich Miescher and the discovery of DNA / R. Dahm //Developmental Biology. - 2005. - № 2. - P. 276.
8. Watson, J. D. Molecular structure of nucleic acids / J. D. Watson, F. H. C. Crick // Nature. -1959. -V. 171. -P. 346.
9. Pal, C. An integrated view of protein evolution / C. Pal, B. Papp, M. Lercher //Nat Rev Genet. -2006. - № 7. - P. 337-348.
10. Концевая, И. И. Микробиология : генетические механизмы изменчивости у бактерий / И. И. Концевая. - Чернигов: Десна Полиграф, 2017. - 36 с.
11. Патрушев, Л. И. Экспрессия генов: монография / Л. И. Патрушев. - Москва: Наука, 2000. - 830 с.
12. Badrinarayanan, A. Bacterial Chromosome Organization and Segregation / A. Badrinarayanan, T. B.K. Le, M.T. Laub // Annual Review of Cell and Developmental Biology. -2015. -V. 31. -P. 171-199.
13. Patino-Navarrete, R. Evolutionary processes and environmental factors underlying the genetic diversity and lifestyles of Bacillus cereus group bacteria / R.Patino-Navarrete, V. Sanchis // Research in Microbiology. - 2017. -V.168, -I. 4. -P. 309-318.
14. Патрушев, Л. И. Искусственные генетические системы / Л. И. Патрушев. - Москва: Наука, 2004. - 530 с.
15. Попова, Н. А. Введение в биологию : учебное пособие / Н. А. Попова. - Новосибирск : НГУ, 2012. - 270 с.
16. Квитко, К. В. Генетика микроорганизмов: учебное пособие / К. В. Квитко, И.А. Захаров. - Санкт Петербург: Изд. дом СПб. ун-та, 2012. - 268 с.
17. Khan, A. Quantifying the forces that maintain prophages in bacterial genomes / A. Khan, L. M. Wahl // Theoretical Population Biology.
-2020. -V. 133. -P. 168-179.
18. Кушкина, А. И. Лизогения у бактерий и её значение для биотехнологии / А. И. Кушкина, Ф. И. Товкач. // Биотехнология. - 2011. - Т. 4, №1. с С. 29-40.
19. KIM, S. Y. Effects of prophage regions in a plasmid carrying a carbapenemase gene on survival against antibiotic stress / S. Y. KIM, K. K. Soo // International Journal of Antimicrobial Agents. - 2019. -V. 53, -I. 1. - P. 89-94.
20. Chakravorty, S. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria / S. Chakravorty, D.Helb, M. Burday, N. Connell, D. Alland // Journal of Microbiological Methods. - 2007. -V. 69, -I. 2. -P. 330-339.
21.Sune, D. Optimization of 16S rRNA gene analysis for use in the diagnostic clinical microbiology service / D. Sune, H. Rydberg, A. N. Augustinsson, L. Serrander, M. B. Jungestrom // Journal of Microbiological Methods. -2020. - V. 170. -P. 105.
22. Claesson, M. J. Comparative Analysis of Pyrosequencing and a Phylogenetic Microarray for Exploring Microbial Community Structures in the Human Distal Intestine / M. J. Claesson, O. O’Sullivan, Q. Wang, J. Nikkila, J. R. Marchesi, H. Smidt, W. M. de Vos, R. P. Ross // PLoS ONE. -
2009. -V. 4, -I. 8. -P. 6669.
23. Ларин, А. К. Определение микробной флоры пигментных желчных камней на основе анализа гена 16S рибосомальной РНК / А. К. Ларин, П. Л. Щербаков, Л. А. Харитонова, О. Н. Царькова, К. Т. Момыналиев // РЖГГК. - 2009. - Т. 19, № 5. - С. 49-54.
24. Cama, J. Breaching the Barrier: Quantifying Antibiotic Permeability across Gram-negative Bacterial Membranes / J. Cama, A. M. Henney, M. Winterhalter // Journal of Molecular Biology. - 2019. -V. 431, -I. 18. -P. 3531-3546.
25. Auda, I. G. Efflux pumps of Gram-negative bacteria in brief / I. G. Auda, I. M. Ali Salman, J. Gh. Odah // Gene Reports. - 2020. -V. 20. -P.100666.
26. Mitra, S. D. Right Place, Right Time: Focalization of Membrane Proteins in Gram-Positive Bacteria / S. D. Mitra, I. Afonina, K. A. Kline // Trends in Microbiology. - 2016. -V. 24, -I. 8. -P. 611-62.
27.Sohrabi, M. The yield and quality of cellular and bacterial DNA extracts from human oral rinse samples are variably affected by the cell lysis methodology / M. Sohrabi, R.G. Nair, L. P. Samaranayake, L. Zhang, A. H. Md.Zulfiker, A. Ahmetagic, D. Gooda, M.Q. Wei // Journal of Microbiological Methods. -2016. -V. 122. -P. 64-72
28. Nair, H. P. Evaluation of five in situ lysis protocols for PCR amenable metagenomic DNA from mangrove soils / H. P.Nair, H.Vincent, S. G.Bhat // Biotechnology Reports. -2014. -V. 4. -P. 134-138.
29. Yang, Y. Specific and effective detection of anammox bacteria using PCR primers targeting the 16S rRNA gene and functional genes / Y. Yang, M. Li, H. Li, X. Li, J. Line, M. Deneck, J. Gu // Science of The Total Environment. -2020. -V. 734. -P.139387.
30. Ребриков, Д. В. ПЦР в реальном времени: учебник / Д. В. Ребриков, Д. В. Саматов, Д. Ю. Трофимов. - Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с.
31.Schochetman, G. Polymerase chain reaction / G. Schochetman, C.-Y. Ou, W.K. Jones // Journal of Infectious Diseases. -1988. -V. 158, -I. 6. -P. 1154-1157.
32. Garibyan, L. Polymerase Chain Reaction / L. Garibyan, N. Avashia // Journal of Investigative Dermatology. -2013. -V. 133, -I. 3. -P. 1-4.
33. Walker, J. M. PCR Protocols / J. M Walker, D. Stirling // Methods in molecular biology. -2003. -V. 226. -P. 405-425.
34. Полимеразная цепная реакция [Электронный ресурс] - Режим доступа: [http://www.ibmc.msk.ru/content/Education/w-o pass/MMoB/10.pdf]
35.Shahi, S. Polymerase chain reaction (PCR)-based methods: Promising molecular tools in dentistry / S. Shahi, S. Z. Vahed, N. Fathi, S. Sharifi // International Journal of Biological Macromolecules. -2018. -V. 117. -P. 983-992.
36. Coulther, T. A. Engineering Polymerases for New Functions / T. A. Coulther, H. R. Stern, P. J. Beuning // Trends in Biotechnology. -2019. -V. 37, -I. 10. -P. 1091-1103.
37. SibEnzyme [Электронный ресурс] - Режим доступа:
[http://russia.sibenzyme.com/products/restrictases1
38. Vesterberg, O. History of electrophoretic methods / O. Vesterberg // Journal of Chromatography A. -1989. -V. 480. -P. 3-19.
39. Поляничко, A. M. Электрофорез в агарозном геле: учебно-методическое пособие / А. М. Поляничко - Москва : Наука, 2007. - 157 с.
40. Hollister, E. B. Chapter 13 - Nucleic Acid-Based Methods of Analysis / E. B. Hollister, J. P. Brooks, T. J. Gentry // Environmental Microbiology (Third edition). -2015. -P. 271-305.
41. Blakely, G. W. DNA Restriction and Modification / G. W. Blakely, N. E. Murray // Encyclopedia of Microbiology (Third Edition). -2009. -P. 538¬549.
42. Lash, L. H. 7.04 - Mechanisms of Toxicant-Induced Acute Kidney Injury / L. H. Lash, B. S. Cummings // Comprehensive Toxicology (Second Edition). -
2010. -V. 7. -P. 81-115.
43. Nazir, R. Chapter 7 - Exploring bacterial diversity: from cell to sequence / R. Nazir, S. Rehman, M. Nisa, U. a. Baba // Freshwater Microbiology Perspectives of Bacterial Dynamics in Lake Ecosystems. -2019. -P. 263-306.
44. Panigrahi, S. Chapter 21 - Functional Microbial Diversity in Contaminated Environment and Application in Bioremediation / S. Panigrahi, P. Velraj, T. S. Rao // Microbial Diversity in the Genomic Era. -2019. -P. 359-385.
45. Chatterjee, S. Chapter 32 - Pathogenic Microbial Genetic Diversity with Reference to Health / S. Chatterjee, I. H. Raval // Microbial Diversity in the Genomic Era. -2019. -P. 559-577.
46. Hoy, M. A. Chapter 13 - Insect Population Ecology and Molecular Genetics / M. A. Hoy // Insect Molecular Genetics (Fourth Edition). -2019. -P. 515¬561.
47. AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit [Электронный ресурс] - Режим доступа:
[https://www.gzsuyan.com/Upload/Product/201508141007437619.pdf].


Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.



Подобные работы


©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.