Помощь студентам в учебе
Проявление адаптационного потенциала Candida albicans в смешанных биопленках с лактобактериями на фоне изменения температуры и рН
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Биоплёнки 8
1.2. Гетерогенность биоплёнок и влияние стрессовых факторов 14
1.3. Способы воздействия на биопленки 17
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 23
2.1. Объекты исследования 23
2.1.1. Lactobacillus plantarum 8PA-3 23
2.1.2. Candida albicans 24
2.1.3. Candida tropicalis 32
2.1.4. Candida parapsilosis 32
2.1.5. Молочная кислота 33
2.2. Методы исследования 35
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 37
3.1. Метод O’Tolle 37
3.2. Метод сканирующей электронной микроскопии 51
3.3. Заключение 59
3.4. Выводы 61
Список литературы 62
Благодарности 65
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Биоплёнки 8
1.2. Гетерогенность биоплёнок и влияние стрессовых факторов 14
1.3. Способы воздействия на биопленки 17
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 23
2.1. Объекты исследования 23
2.1.1. Lactobacillus plantarum 8PA-3 23
2.1.2. Candida albicans 24
2.1.3. Candida tropicalis 32
2.1.4. Candida parapsilosis 32
2.1.5. Молочная кислота 33
2.2. Методы исследования 35
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 37
3.1. Метод O’Tolle 37
3.2. Метод сканирующей электронной микроскопии 51
3.3. Заключение 59
3.4. Выводы 61
Список литературы 62
Благодарности 65
Современные представления об инфекционных заболеваниях человека включают в себя понятие о способности микроорганизмов к сосуществованию в виде биоплёночных сообществ. Формирование биоплёнок ведёт к значительному снижению эффективности терапии, повышает количество осложнений, вероятность хронизации и генерализации инфекционного процесса[1,2]. Доказана существенная роль биоплёнок в появлении госпитальных штаммов и их связь с катетер-ассоциированными, вентилятор-ассоциированными инфекциями. Эта особенность характерна для большого количества микроорганизмов, включая микроскопические грибы[3]. Биопленки могут повышать устойчивость микроорганизмов к ультрафиолетовому излучению, температурному фактору и pH, высокому содержанию солей в среде, высокому давлению, недостатку питательных веществ, антибиотикам и другим неблагоприятным факторам[4]. Именно поэтому исследованию способности микроорганизмов к формированию сообществ посвящено множество работ в области фундаментальных биологических наук и в сфере клинических дисциплин. Одним из наиболее перспективных направлений является анализ межвидовых взаимодействий микроорганизмов, способных к биоплёнкообразованию.
Микроскопические грибы рода Candida являются наиболее распространенной причиной развития грибковых инфекций. При проявлении патогенных свойств клетки Candida spp. могут изменять свои морфофизиологические параметры и образовывать микробные сообщества в виде биоплёнок. Сформированные биопленки Candida spp. снижают эффективность воздействия противогрибковых препаратов и приводят к появлению резистентных штаммов.
В организме человека микроскопические грибы рода Candidaприсутствуют в составе нормальной микробиоты, преимущественно ротовой полости и влагалища; при этом в данных областях одними из доминирующих микроорганизмов являются грамположительные бактерии рода Lactobacillus[5,6].Бактерии рода Lactobacillus обладают способностью к выделению ряда веществ, в частности, молочной кислоты, которые потенциально могут влиять на другие микроорганизмы, в том числе и на биоплёнки микроскопических грибов.
Настоящее исследование посвящено анализу эффекта, оказываемого супернатантом лактобактерий Lactobacillus plantarum 8РА-3 на клетки и биоплёнки грибов рода Candida. На данный момент в научной литературе есть ряд исследований, посвящённых этому вопросу, однако их результаты зачастую противоречивы и не позволяют сделать выводы о влиянии внешних факторов на действие супернатанта лактобактерий. Необходимо учитывать, что инфекционные процессы, в том числе первичный и вторичный кандидоз, зачастую сопровождаются реакциями макроорганизма, проявляющимися в том числе изменением базальной температуры и кислотно-основного равновесия. Эффект, оказываемый лактобактериями на клетки и биоплёнки микроскопических грибов, может изменяться в зависимости от факторов внешней среды.
Цель исследования
Анализ деструктивных изменений в клетках и биоплёнках микроскопических грибов рода Candida spp. при воздействии супернатанта лактобактерий Lactobacillus plantarum 8РА-3 на фоне изменения температурного режима и уровня pH среды культивирования.
Задачи исследования
1. Оценить способность микроскопических грибов рода Candidaк формированию биоплёнок при воздействии супернатанта Lactobacillus plantarum 8РА-3 при разных температурных режимах культивирования.
2. Изучить влияние действия раствора фосфатного буфера и молочной кислоты на клетки грибов рода Candida и их биоплёнки.
3. Провести анализ биоплёнкообразования и морфологических изменений в клетках грибов рода Candidaпри сочетанном воздействии супернатанта Lactobacillus plantarum 8РА-3 и раствора фосфатного буфера либо молочной кислоты.
Микроскопические грибы рода Candida являются наиболее распространенной причиной развития грибковых инфекций. При проявлении патогенных свойств клетки Candida spp. могут изменять свои морфофизиологические параметры и образовывать микробные сообщества в виде биоплёнок. Сформированные биопленки Candida spp. снижают эффективность воздействия противогрибковых препаратов и приводят к появлению резистентных штаммов.
В организме человека микроскопические грибы рода Candidaприсутствуют в составе нормальной микробиоты, преимущественно ротовой полости и влагалища; при этом в данных областях одними из доминирующих микроорганизмов являются грамположительные бактерии рода Lactobacillus[5,6].Бактерии рода Lactobacillus обладают способностью к выделению ряда веществ, в частности, молочной кислоты, которые потенциально могут влиять на другие микроорганизмы, в том числе и на биоплёнки микроскопических грибов.
Настоящее исследование посвящено анализу эффекта, оказываемого супернатантом лактобактерий Lactobacillus plantarum 8РА-3 на клетки и биоплёнки грибов рода Candida. На данный момент в научной литературе есть ряд исследований, посвящённых этому вопросу, однако их результаты зачастую противоречивы и не позволяют сделать выводы о влиянии внешних факторов на действие супернатанта лактобактерий. Необходимо учитывать, что инфекционные процессы, в том числе первичный и вторичный кандидоз, зачастую сопровождаются реакциями макроорганизма, проявляющимися в том числе изменением базальной температуры и кислотно-основного равновесия. Эффект, оказываемый лактобактериями на клетки и биоплёнки микроскопических грибов, может изменяться в зависимости от факторов внешней среды.
Цель исследования
Анализ деструктивных изменений в клетках и биоплёнках микроскопических грибов рода Candida spp. при воздействии супернатанта лактобактерий Lactobacillus plantarum 8РА-3 на фоне изменения температурного режима и уровня pH среды культивирования.
Задачи исследования
1. Оценить способность микроскопических грибов рода Candidaк формированию биоплёнок при воздействии супернатанта Lactobacillus plantarum 8РА-3 при разных температурных режимах культивирования.
2. Изучить влияние действия раствора фосфатного буфера и молочной кислоты на клетки грибов рода Candida и их биоплёнки.
3. Провести анализ биоплёнкообразования и морфологических изменений в клетках грибов рода Candidaпри сочетанном воздействии супернатанта Lactobacillus plantarum 8РА-3 и раствора фосфатного буфера либо молочной кислоты.
В контрольных образцах всех исследованных культур Candida выявлены многослойные скопления клеток в виде биопленок. Микроскопические грибы имели характерную стандартную форму и размеры клеток. Добавление буфера и молочной кислоты в контрольные образцы к статистически значимым изменениям не приводило. Добавление в среду выращивания грибов супернатанта L. plantarum 8РА-3 вызывало при 37 и 39°С уменьшение площади формирования биопленок в 3–72 раза, увеличение численности деструктурированных и лизированных клеток.
Сочетанное воздействие супернатанта L. plantarum 8РА-3 с буфером или кислотой не приводило к существенным изменениям указанных выше параметров роста грибов при температуре 30 и 39°С.Поскольку при этих условиях ожидалось соответственно ингибирование и потенцирование эффекта, оказываемого молочной кислотой, можно предположить, что основным механизмом воздействия супернатанта не являлось воздействие молочной кислотой. Лактобактерии L. plantarum8РА-3 способны вырабатывать и другие факторы агрессии [49,50], которые, вероятно, вносят основной вклад в подавление роста и биоплёнкообразования грибов рода Candida.
В опытных образцах С. albicans, С. tropicalisи C. parapsilosis при 37 и 39°С наблюдали статистически значимое увеличение размеров клеток, по сравнению с контролем, а также изменение структуры клеточной стенки. В то же время существенных изменений при температуре 30°С обнаружено не было. Микроскопические грибы рода Candidaобладают сложным механизмом регуляции метаболических процессов, который влияет в том числе и на размеры клеток[51], поэтому увеличение размера клеток может быть как проявлением реакции непосредственно клеток микроскопических грибов, так и патологическим процессом, развившимся в результате агрессивного влияния факторов, выделяемых лактобактериями L. plantarum.
Таким образом, в ходе анализа полученных данных обнаружено, что супернатант L. plantarum 8РА-3 вызывал существенное снижение способности к биоплёнкообразованию всех исследованных видов грибов Candida. На уровне световой микроскопии выявлены признаки ингибирования развития биопленок Сandidaspp супернатантом лактобактерий. На уровне электронной микроскопии выявлены признаки изменения морфологических свойств клеток Candidaspp.Изменение pН среды до 3.5 не отразилось на морфологических свойствах клеток и биопленок грибов. Значительные изменения морфологических свойств клеток грибов при воздействии супернатанта свидетельствовали о деструктивных процессах, ведущих к их деградации.
Вырабатываемые лактобактериями Lactobacillus plantarum 8РА-3 факторы агрессии оказывали выраженное подавляющее действие на клетки и биоплёнки микроскопических грибов рода Candida, причём молочная кислота не являлась основным фактором агрессии. Этот эффект находится в прямой зависимости с температурными условиями и не зависит от pH окружающей среды.
Сочетанное воздействие супернатанта L. plantarum 8РА-3 с буфером или кислотой не приводило к существенным изменениям указанных выше параметров роста грибов при температуре 30 и 39°С.Поскольку при этих условиях ожидалось соответственно ингибирование и потенцирование эффекта, оказываемого молочной кислотой, можно предположить, что основным механизмом воздействия супернатанта не являлось воздействие молочной кислотой. Лактобактерии L. plantarum8РА-3 способны вырабатывать и другие факторы агрессии [49,50], которые, вероятно, вносят основной вклад в подавление роста и биоплёнкообразования грибов рода Candida.
В опытных образцах С. albicans, С. tropicalisи C. parapsilosis при 37 и 39°С наблюдали статистически значимое увеличение размеров клеток, по сравнению с контролем, а также изменение структуры клеточной стенки. В то же время существенных изменений при температуре 30°С обнаружено не было. Микроскопические грибы рода Candidaобладают сложным механизмом регуляции метаболических процессов, который влияет в том числе и на размеры клеток[51], поэтому увеличение размера клеток может быть как проявлением реакции непосредственно клеток микроскопических грибов, так и патологическим процессом, развившимся в результате агрессивного влияния факторов, выделяемых лактобактериями L. plantarum.
Таким образом, в ходе анализа полученных данных обнаружено, что супернатант L. plantarum 8РА-3 вызывал существенное снижение способности к биоплёнкообразованию всех исследованных видов грибов Candida. На уровне световой микроскопии выявлены признаки ингибирования развития биопленок Сandidaspp супернатантом лактобактерий. На уровне электронной микроскопии выявлены признаки изменения морфологических свойств клеток Candidaspp.Изменение pН среды до 3.5 не отразилось на морфологических свойствах клеток и биопленок грибов. Значительные изменения морфологических свойств клеток грибов при воздействии супернатанта свидетельствовали о деструктивных процессах, ведущих к их деградации.
Вырабатываемые лактобактериями Lactobacillus plantarum 8РА-3 факторы агрессии оказывали выраженное подавляющее действие на клетки и биоплёнки микроскопических грибов рода Candida, причём молочная кислота не являлась основным фактором агрессии. Этот эффект находится в прямой зависимости с температурными условиями и не зависит от pH окружающей среды.