Введение 4
Глава 1. Золотые наночастицы 4
§1 Синтез золотых наночастиц 4
§2 Поверхностный плазмонный резонанс ЗНЧ 7
Глава 2. Молекула ДНК 8
§1 Состав нуклеотида в молекуле ДНК 8
§2 Образование биополимера ДНК. Вторичная структура ДНК 8
Глава 3. Конъюгаты ДНК с золотыми наночастицами 10
§1 Механизмы связывания 10
§2 Конъюгаты тиолированных ДНК с золотыми наночастицами 11
§3 Конъюгаты нетиолированных ДНК с золотыми наночастицами. Конъюгаты двухблочной ДНК с золотыми наночастицами 12
§4 Свойства и методы характеризации тиолированных и двухблочных ДНК конъюгатов с золотыми наночастицами 14
ДНК как стабилизатор золотых наночастиц 14
Температурная устойчивость конъюгатов 15
Прочность адсорбции полиадениновых последовательностей ДНК 15
Динамическое светорассеяние тиолированных и двухблочных конъюгатов 16
Кинетика гибридизации конъюгатов 16
Наноструктуры на основе конъюгатов ДНК с золотыми наночастицами 17
Глава 4. Материалы и методы 21
§1 Материалы 21
Приготовление буферов 23
§2 Методы 23
Спектрофотометрия 23
Электрофорез 24
Флюорометрия 25
Атомно-силовая микроскопия 26
pH-метрия 27
Коррекция на поглощение света золотыми наночастицами в опытах по измерению
интенсивности флюоресценции 29
Глава 5. Результаты и их обсуждение 29
§1 Синтез золотых наночастиц 29
§2 Атомно-силовая микроскопия золотых наночастиц 30
§3 Спектрофотомерия золотых наночастиц 32
§4 Подготовка олигонуклеотидов 33
§5 Приготовление конъюгатов полиА с золотыми наночастицами 34
§6 Электрофорез конъюгатов аденинового олигонуклеотида с золотыми наночастицами при разных соотношениях концентраций конъюгирующих соединений 34
§7 Электрофорез конъюгатов аденинового олигонуклеотида с золотыми наночастицами при разных pH 37 §8 Флюорометрия конъюгатов при разных соотношениях концентраций конъюгирующих
соединений 39
§9 Флюорометрия конъюгатов при разных pH 42
Подбор концентраций CB и SB в конечном растворе 43
§10 Конкуренция за связывание с золотыми наночастицами между полиадениновыми
олигонуклеотидами и молекулой дАТФ 44
аптамер к молекуле АТФ (функциональная часть) 48
Электрофорез 48
Флюорометрия 50
Выводы 52
Используемая литература
Золотые наночастицы (ЗНЧ) вот уже на протяжении десятилетий вызывают большой научный интерес благодаря уникальным оптическим свойствам. Одно из них - поверхностный плазмонный резонанс (ППР). ЗНЧ нетоксичны, обладают высокой стабильностью, высоким коэффициентом молярной экстинкции, имеют возможность усиливать комбинационное рассеяние света и являются хорошим тушителем для некоторых флюорофоров. Эти свойства позволяют применять ЗНЧ во многих областях, например, в биосенсорике, молекулярной визуализации, лечении заболеваний фототермическим путем [1],[3].
ЗНЧ являются хорошо изученным наноматериалом. Успешно разработаны методики синтеза ЗНЧ разных размеров с высокой точностью. Также известны соединения, придающие им коллоидную стабильность [2],[7],[8].
Наконец, биополимеры, модифицированные тиолом (тиолированные), могут связываться с поверхностью ЗНЧ путем хемосорбции, сопровождающейся образованием ковалентной связи серы с золотом. Белки и нуклеиновые кислоты без тиоловых групп также могут подвергаться адсорбции на поверхность ЗНЧ [4].
Адсорбцию на поверхность ЗНЧ можно с высокой точностью детектировать с помощью спектрофотометрических методов (благодаря ППР золотых наночастиц), а также с помощью спектрофлюорометрии (ЗНЧ является тушителем флюоресценции) [5].
Молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) - хорошо изученный биополимер, позволяющий создавать наноструктуры с заранее заданной геометрией. Определенные последовательности молекулы ДНК (аптамеры) могут связываться с соединениями (мишенями) с высокой специфичностью.
Конъюгатам ЗНЧ-ДНК свойственны достоинства обоих материалов. Поверхность золотых наночастиц обеспечивает многочисленные сайты связывания для ДНК, что приводит к высокой эффективности адсорбции. При адсорбции ДНК стабилизирует ЗНЧ, препятствуя их агрегации [19]. Наночастицы также оказывают защитное воздействие на молекулу ДНК, предотвращая ее ферментативную деградацию [6].
Таким образом, понимание процесса связывания между ДНК и ЗНЧ становится актуальной задачей для исследования.
В данной работе был синтезирован раствор золотых наночастиц. При подборе нужной концентрации раствора ЗНЧ и экранирующих ионов, можно получить изображение АСМ для ЗНЧ и по нему оценить средний размер золотой наночастицы. Сравнивая размеры ЗНЧ, синтезированные по одинаковому протоколу в научной литературе и в лаборатории, можно заключить, что по порядку величины совпадают. Скорее всего, величины были бы равны в пределах погрешностей, однако в [2] упоминается только средний диаметр ЗНЧ:
Следовательно, синтез по данному протоколу хорошо воспроизводим. Атомно-силовая микроскопия, наравне с используемой в научной литературе сканирующей электронной микроскопией и динамическим светорассеянием, является хорошим методом для оценки размеров ЗНЧ.
Спектр поглощения ЗНЧ, полученный с помощью спектрофотометра, является характерным для ЗНЧ: он имеет максимум в диапазоне [500 нм; 530 нм]. Наличие пика поглощения в этом диапазоне возникает в следствие поверхностно-плазмонного резонанса ЗНЧ; Красный цвет раствора возникает из-за поглощения в этом диапазоне длин волн.
При помощи данных из научной литературы и электрофореза при разных соотношениях конъюгирующих соединений сделан вывод, что максимальное число синтезированных ЗНЧ, адсорбирующихся на поверхность ЗНЧ, больше единицы. Электрофорез конъюгатов при разных pH получился не слишком информативным из-за недостатка: не была подготовлена проба чистых ЗНЧ. Подводя итог по двум опытам, можно сказать, что процесс адсорбции выходит к насыщению как при понижении pH, так и при уменьшении концентрации адсорбирующего олигонуклеотида. Выход к насыщению можно объяснить тем, что в некоторый момент количество сайтов связывания на поверхности ЗНЧ становится больше, чем количество нитей полиА и все олигонуклеотиды адсорбируются на поверхность ЗНЧ.
Адсорбция полиА на поверхность ЗНЧ при разных pH была исследована не только с помощью электрофореза, но и спектрофлюорометрически. Результаты двух экспериментов аналогичны, что говорит об комплементарности экспериментов.
Проведены эксперименты по конкурентному связыванию ЗНЧ с олигонуклеотидами (в т. ч. с олигонуклеотидами с функциональной ДНК) и молекулой дАТФ. Эффект смещения адсорбированного соединения виден, но незначителен. Существует необходимость в дальнейшем исследовании явления конкурентного связывания. В качестве изменяемых параметров можно использовать не только длину полиА и концентрации соединений, а также pH, ионную силу, температуру, время выдержки проб. Все это открывает большую перспективу для дальнейших исследований.
