Введение 4
1. Обзор литературы 6
1.1. Пластичность кариотипа в клетках в культуре при опухолевой трансформации и при
стрессовом воздействии 6
1.1.1. Значение изучения перестроек кариотипа в культивируемых и опухолевых клетках... .6
1.1.2. Перестройки кариотипа в различных культурах клеток птиц 8
1.2. Метод Hi-C как источник данных о структуре генома 11
1.2.1 Принцип метода Hi-C 11
1.2.2. Вклад данных Hi-C в сборку геномов 16
1.2.3. Анализ перестроек кариотипа с помощью Hi-C анализа 17
2. Материалы и методы 24
2.1 Культивирование клеток 24
2.2 Приготовление препаратов метафазных хромосом 24
2.3 Анализ тепловых карт Hi-C 24
2.4. Зонды для флуоресцентной гибридизации in situ 25
2.4.1. Мечение зондов методом ПЦР со специфичными праймерами 27
2.4.2. Мечение зондов методом DOP-ПЦР 28
2.4.3. Мечение зондов методом ник-трансляции 28
2.5. Флуоресцентная гибридизация in situ 29
2.6. Микроскопия и обработка изображений 31
3. Результаты 32
3.1. Анализ тепловых Hi-C карт клеток линии HD3 32
3.2. Верификация хромосомных перестроек в клетках линии HD3 методом FISH 40
4. Обсуждение 46
Выводы 49
Благодарности 50
Список цитируемой литературы 51
Выбор объекта является одним из ключевых этапов планирования эксперимента. От этого может зависеть не только качество получаемых результатов, но и возможность получить достоверный результат. В истории науки известна масса примеров выбора крайне удачного, или, наоборот, совершенно неподходящего объекта. Так, например, краб Cancer borealis оказался удобным организмом для биохимического исследования ДНК; в выделенных образцах после ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия была обнаружена фракция АТ-богатой сателлитной ДНК. Интересно, что у этого организма сателлитная ДНК составляет существенный процент генома - порядка 30%, благодаря чему исследователям удалось заметить такую гетерогенность (Sueoka 1961). По мере углубления представлений о строении клеток и происходящих в них процессах внимание исследователей сосредоточилось на работе с клетками. В норме у животных с выраженной тканевой организацией клетки присутствуют в составе тканей и не могут существовать вне организма, в связи с этим у исследователей возникла серьёзная методологическая проблема работы с выделенными клетками и сопоставления данных, полученных на разных типах клеток. С установлением в 50-е годы первой клеточной линии, получившей название HeLa, стала возможна продолжительная работа на клетках (Gey, Coffman, and Kubicek 1952), и в течение короткого времени многие лаборатории перешли на работу с этими клетками. Широкое использование клеток HeLa в качестве объекта исследования позволяло сравнивать и воспроизводить полученные в разных лабораториях результаты, благодаря чему увеличилась скорость накопления новых знаний. Иными словами, клетки HeLa стали модельным объектом клеточной и молекулярной биологии. Также установление постоянной клеточной линии позволило работать непосредственно с клетками человека, не прибегая к забору материала у доноров или использованию лабораторных животных. Однако, дальнейшие исследования показали, что трансформированные клетки, к которым относится и HeLa, в условиях как in vivo,так и in vitroхарактеризуются повышенной нестабильностью генетического материала (Radman and Kinsella 1980; Radman, Jeggo, Wagner 1982; Savelyeva and Mamaeva 1987), в результате чего в кариотипе возникают и накапливаются различные хромосомные перестройки. Как оказалось, такие изменения влекут сдвиги нормального профиля экспрессии генов и, как следствие, могут влиять на многие внутриклеточные процессы (Hnisz et al. 2016; Harewood et al. 2017).
Линия эритробластов курицы HD3 была получена в 80-е годы прошлого века в результате трансформации колониеобразующей единицы эритроидного ряда вирусом эритробластоза птиц AEV (Beug et al. 1982). Линия является удобным объектом исследования эритроидной дифференцировки у птиц in vitro (Beug et al. 1982; Ulianov et al. 2017). Однако на сегодняшний день систематических исследований сохранности генома клеток линии HD3 проведено не было, а, значит, влияние хромосомных перестроек на происходящие при дифференцировке этих клеток процессы оставалось неизвестным.
Цель настоящей работы: выявить перестройки кариотипа клеток линии HD3 эритробластов курицы с помощью метода Hi-C и верифицировать их при помощи флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
Конкретные задачи исследования:
1. Выявить аномалии в организации внутри- и межхромосомных взаимодействий на тепловых Hi-C картах контактов хроматина клеток линии HD3.
2. Верифицировать обнаруженные на тепловых Hi-C картах перестройки кариотипа при помощи метода флуоресцентной гибридизации in situ.
3. Оценить вклад перестроек в структуру кариотипа клеток линии HD3.
1. Кариотип линии HD3 эритробластов курицы претерпел существенные изменения.
2. Трансформация кариотипа клеток линии HD3 происходила преимущественно путём несбалансированных межхромосомных транслокаций.
3. Метод Hi-C показал высокую эффективность в обнаружении хромосомных перестроек в кариотипах птиц с большим числом микрохромосом.
