Аннотация 2
Определения, обозначения и сокращения 5
Введение 7
1 Литературный обзор 9
1.1 Целенаправленная деградация белка как новая
фармакологическая стратегия 9
1.2 Основные направления молекулярного дизайна PROTAC 12
1.3 Характеристики ADMET в разработках PROTAC 18
1.4 Методы измерения клеточной проницаемости 28
1.5 Важность прогнозирования ADMET-характеристик 32
2 Результаты и их обсуждения 35
2.1 Оценка стабильности новых лигандов CRBN 35
2.2 Исследование проницаемости молекул PROTAC 45
3 Экспериментальная часть 49
3.1 Реагенты и оборудование 49
3.2 Биологический эксперимент 50
Заключение 53
Список используемой литературы 54
Приложение А Хроматограммы лигандов CRBN 60
Приложение Б Предварительное исследование стабильности лигандов CRBN 62
Приложение В Хроматограммы молекул PROTAC 64
Приложение Г Исследование проницаемости молекул PROTAC 65
Химиотерапия, традиционный метод лечения, играет важную роль в процессе лечения раковых опухолей. Однако основными недостатками противоопухолевых препаратов являются низкая селективность и высокая вероятность развития лекарственной устойчивости. Как результат, внимание фармакологов привлекла таргетная терапия рака.
В последние десятилетия большой интерес вызывают новые стратегии, направленные на деградацию белков, опосредующих опухолевую активность. Концепция PROTAC основана на конструировании низкомолекулярных бифункциональных структур, которые обладают высоким сродством к мишеням и связываются с убиквитинлигазами. Такие конъюгаты опосредуют транспорт надмолекулярного комплекса к протеасоме и расщепляют специфические эндогенные белки.
Ввиду интереса к терапевтическому действию молекул PROTAC, очевидно, что существует необходимость в детальном изучении их физикохимических свойств. Учитывая их высокую молекулярную массу и наличие нескольких доноров (HBD) и акцепторов (HBA) водородной связи, можно предположить их низкую клеточную проницаемость. PROTAC находится в химическом пространстве «за пределами правила пяти». Следовательно, низкая клеточная проницаемость и другие фармакокинетические недостатки молекулы могут препятствовать абсорбированию при пероральном приеме и связыванию со своей мишенью. PROTAC на основе лигандов CRBN занимает химическое пространство, которое частично перекрывается с пространством «правила пяти», тогда как на основе VHL и других лигандов E3- лигаз занимают более отдаленное пространство. Это, возможно, и объясняет тот факт, что в клинических исследованиях в большинстве используют именно PROTAC на основе CRBN.
Для оценки кишечной проницаемости лекарственных препаратов успешно применяются клетки карциномы кишечника Caco-2, которые морфологически и функционально схожи с барьерным эпителием кишечника.
Целью представленной работы является исследование стабильности новых лигандов CRBN и клеточной проницаемости химерных молекул, направленных на протеолиз (PROTAC).
В соответствии с обозначенной целью в данной работе поставлены следующие задачи:
• Провести предварительное исследование стабильности новых лигандов CRBN;
• Провести оценку стабильности лигандов CRBN в фосфатном буферном растворе и полной ростовой среде;
• Провести анализ клеточной проницаемости с использованием монослоя клеток Caco-2;
• Определить значения коэффициента кажущейся проницаемости молекул PROTAC с использованием метода ВЭЖХ.
Проведен обзор соответствующей литературы и представлены доступные методы измерения ADME характеристик PROTAC. Все эти характеристики влияют на уровень и кинетику действия лекарственного препарата и, таким образом, на лекарственную эффективность.
Проведена предварительная оценка стабильности новых лигандов CRBN с использованием метода ВЭЖХ. Концентрацию соединений определяли методом градуировочного графика. Согласно методике, исследуемые соединения инкубировали в течение 24 часов в полной ростовой среде RPMI- 1640, после чего анализировали изменение концентрации. По результатам эксперимента, все соединения обладают достаточной стабильностью.
Оценена стабильность 25 лигандов CRBN в фосфатном буферном растворе в аналогичных условиях. По результатам эксперимента, соединения распадаются после инкубации в течение 24 часов. Соединения с алкильными заместителями гидролизуются быстрее, чем соединения, имеющие арильные заместители в третьем положении изоксазольного фрагмента. Предпринята попытка провести эксперимент в полной ростовой среде, однако по ряду технических причин это пока не удалось осуществить.
Была использована стандартная методика анализа клеточной проницаемости с использованием модели клеток Caco-2. Концентрации исследуемых соединений в базолатеральной и апикальной частях определяли методом ВЭЖХ. По результатам полученного коэффициента кажущейся проницаемости, рассмотренные молекулы PROTAC обладают низкими значениями проницаемости в апикальной камере в диапазоне 1.29 X 10-6 - 2.13 X 10-6 см/с и базолатеральной камере в диапазоне 1.71 X 10-6 - 2.38 X 10-6 см/с. Эти данные свидетельствуют о преобладании процессов притока (транспорт по направлению из просвета кишечника в энтероциты) над процессами оттока (транспорт из клеток кишечника в просвет кишечника).
