Клеточная проницаемость молекул, ориентированных на протеолиз цереблона,

Содержание

Аннотация 2
Определения, обозначения и сокращения 5
Введение 7
1 Литературный обзор 9
1.1 Целенаправленная деградация белка как новая
фармакологическая стратегия 9
1.2 Основные направления молекулярного дизайна PROTAC 12
1.3 Характеристики ADMET в разработках PROTAC 18
1.4 Методы измерения клеточной проницаемости 28
1.5 Важность прогнозирования ADMET-характеристик 32
2 Результаты и их обсуждения 35
2.1 Оценка стабильности новых лигандов CRBN 35
2.2 Исследование проницаемости молекул PROTAC 45
3 Экспериментальная часть 49
3.1 Реагенты и оборудование 49
3.2 Биологический эксперимент 50
Заключение 53
Список используемой литературы 54
Приложение А Хроматограммы лигандов CRBN 60
Приложение Б Предварительное исследование стабильности лигандов CRBN 62
Приложение В Хроматограммы молекул PROTAC 64
Приложение Г Исследование проницаемости молекул PROTAC 65

Введение

Химиотерапия, традиционный метод лечения, играет важную роль в процессе лечения раковых опухолей. Однако основными недостатками противоопухолевых препаратов являются низкая селективность и высокая вероятность развития лекарственной устойчивости. Как результат, внимание фармакологов привлекла таргетная терапия рака.
В последние десятилетия большой интерес вызывают новые стратегии, направленные на деградацию белков, опосредующих опухолевую активность. Концепция PROTAC основана на конструировании низкомолекулярных бифункциональных структур, которые обладают высоким сродством к мишеням и связываются с убиквитинлигазами. Такие конъюгаты опосредуют транспорт надмолекулярного комплекса к протеасоме и расщепляют специфические эндогенные белки.
Ввиду интереса к терапевтическому действию молекул PROTAC, очевидно, что существует необходимость в детальном изучении их физикохимических свойств. Учитывая их высокую молекулярную массу и наличие нескольких доноров (HBD) и акцепторов (HBA) водородной связи, можно предположить их низкую клеточную проницаемость. PROTAC находится в химическом пространстве «за пределами правила пяти». Следовательно, низкая клеточная проницаемость и другие фармакокинетические недостатки молекулы могут препятствовать абсорбированию при пероральном приеме и связыванию со своей мишенью. PROTAC на основе лигандов CRBN занимает химическое пространство, которое частично перекрывается с пространством «правила пяти», тогда как на основе VHL и других лигандов E3- лигаз занимают более отдаленное пространство. Это, возможно, и объясняет тот факт, что в клинических исследованиях в большинстве используют именно PROTAC на основе CRBN.
Для оценки кишечной проницаемости лекарственных препаратов успешно применяются клетки карциномы кишечника Caco-2, которые морфологически и функционально схожи с барьерным эпителием кишечника.
Целью представленной работы является исследование стабильности новых лигандов CRBN и клеточной проницаемости химерных молекул, направленных на протеолиз (PROTAC).
В соответствии с обозначенной целью в данной работе поставлены следующие задачи:
• Провести предварительное исследование стабильности новых лигандов CRBN;
• Провести оценку стабильности лигандов CRBN в фосфатном буферном растворе и полной ростовой среде;
• Провести анализ клеточной проницаемости с использованием монослоя клеток Caco-2;
• Определить значения коэффициента кажущейся проницаемости молекул PROTAC с использованием метода ВЭЖХ.

Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!

ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ

КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

Заключение

Проведен обзор соответствующей литературы и представлены доступные методы измерения ADME характеристик PROTAC. Все эти характеристики влияют на уровень и кинетику действия лекарственного препарата и, таким образом, на лекарственную эффективность.
Проведена предварительная оценка стабильности новых лигандов CRBN с использованием метода ВЭЖХ. Концентрацию соединений определяли методом градуировочного графика. Согласно методике, исследуемые соединения инкубировали в течение 24 часов в полной ростовой среде RPMI- 1640, после чего анализировали изменение концентрации. По результатам эксперимента, все соединения обладают достаточной стабильностью.
Оценена стабильность 25 лигандов CRBN в фосфатном буферном растворе в аналогичных условиях. По результатам эксперимента, соединения распадаются после инкубации в течение 24 часов. Соединения с алкильными заместителями гидролизуются быстрее, чем соединения, имеющие арильные заместители в третьем положении изоксазольного фрагмента. Предпринята попытка провести эксперимент в полной ростовой среде, однако по ряду технических причин это пока не удалось осуществить.
Была использована стандартная методика анализа клеточной проницаемости с использованием модели клеток Caco-2. Концентрации исследуемых соединений в базолатеральной и апикальной частях определяли методом ВЭЖХ. По результатам полученного коэффициента кажущейся проницаемости, рассмотренные молекулы PROTAC обладают низкими значениями проницаемости в апикальной камере в диапазоне 1.29 X 10-6 - 2.13 X 10-6 см/с и базолатеральной камере в диапазоне 1.71 X 10-6 - 2.38 X 10-6 см/с. Эти данные свидетельствуют о преобладании процессов притока (транспорт по направлению из просвета кишечника в энтероциты) над процессами оттока (транспорт из клеток кишечника в просвет кишечника).

Литература

1. Sakamoto K. M. et al. Protacs: Chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2001. - V. 98. - №. 15. - P. 8554-8559.
2. Zhao Y., Sun Y. Cullin-RING Ligases as attractive anti-cancer targets // Current pharmaceutical design. - 2013. - V. 19. - №. 18. - P. 3215-3225.
3. Li X. et al. Proteolysis-targeting chimeras (PROTACs) in cancer therapy // Molecular Cancer. - 2022. - V. 21. - №. 1. - P. 1-30.
4. Li X., Song Y. Proteolysis-targeting chimera (PROTAC) for targeted protein degradation and cancer therapy // Journal of Hematology & Oncology. - 2020. - V. 13. - №. 1. - P. 1-14.
5. Paiva S. L., Crews C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design // Current opinion in chemical biology. - 2019. - V. 50. - P. 111119.
6. Qi S. M. et al. PROTAC: an effective targeted protein degradation strategy for cancer therapy // Frontiers in Pharmacology. - 2021. - V. 12. - P. 574-590.
7. Sun X., Rao Y. PROTACs as potential therapeutic agents for cancer drug resistance // Biochemistry. - 2019. - V. 59. - №. 3. - P. 240-249.
8. Ermondi G. et al. Rational control of molecular properties is mandatory to exploit the potential of PROTACs as oral drugs // ACS Medicinal Chemistry Letters. - 2021. - V. 12. - №. 7. - P. 1056-1060.
9. Cecchini C. et al. From conception to development: investigating PROTACs features for improved cell permeability and successful protein degradation // Frontiers in Chemistry. - 2021. - V. 9. - P. 672-690.
10. Gleeson M. P. Generation of a set of simple, interpretable ADMET rules of thumb // Journal of Medicinal Chemistry. - 2008. - V. 51. - №. 4. - P. 817-834.
11. Sakamoto K. M. et al. Development of Protacs to target cancerpromoting proteins for ubiquitination and degradation // Molecular & Cellular Proteomics. - 2003. - V. 2. - №. 12. - P. 1350-1358.
12. Schneekloth A. R. et al. Targeted intracellular protein degradation induced by a small molecule: En route to chemical proteomics // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. - 2008. - V. 18. - №. 22. - P. 5904-5908.
13. Buckley D. L. et al. Targeting the von Hippel-Lindau E3 ubiquitin ligase using small molecules to disrupt the VHL/HIF-1a interaction // Journal of the American Chemical Society. - 2012. - V. 134. - №. 10. - P. 4465-4468.
14. Galdeano C. et al. Structure-guided design and optimization of small molecules targeting the protein-protein interaction between the von Hippel-Lindau (VHL) E3 ubiquitin ligase and the hypoxia inducible factor (HIF) alpha subunit with in vitro nanomolar affinities // Journal of Medicinal Chemistry. - 2014. - V. 57. - №. 20. - P. 8657-8663.
15. Bondeson D. P. et al. Catalytic in vivo protein knockdown by smallmolecule PROTACs // Nature chemical biology. - 2015. - V. 11. - №. 8. - P. 611617.
... всего 56 источников