Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
ℹ️Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Меристемы растений
1.1.1. Генная регуляция развития и поддержания меристем
1.1.2. Роль генов контроля клеточного цикла в регуляции меристем
1.1.3. Роль гормонов в регуляции меристем
1.2. Опухолеобразование у растений
1.2.1. Спонтанное опухолеобразование у растений
1.2.2. Патоген-индуцированное опухолеобразование у растений
1.3. Другие дополнительные меристемы растений
1.3.1. Меристемы клубеньков у растений
1.3.2. Каллусообразование у растений
1.3.3. Соматический эмбриогенез у растений
1.4. РНК-секвенирование растений
1.4.1. Примеры применения РНК-секвенирования в транскриптомике
растений
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Методы обработки данных
2.3 Выделение РНК из опухоли и нормального корня, получение кДНК
и проверка экспрессии генов при помощи ПЦР в реальном времени
2.4 Амплификация фрагментов ДНК и выделение фрагментов из
агарозного геля
2.5 Клонирование фрагментов в векторы экспрессии методом GateWay
2.6 Трансформация бактерий Escherichia coli и Agrobacteruim rhizogenes
2.7 Выделение плазмид и рестрикционное картирование
2.8 Условия выращивания растений и трансформация при помощи
Agrobacterium rhizogenes
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 37
3.1. Анализ качества и очистка прочтений 37
3.2. Сборка транскриптомов редиса и их сравнение 38
3.3. Функциональная аннотация транскриптома
3.4. Анализ дифференциальной экспрессии генов
3.5. Анализ обогащения функциональных групп генов
3.6. Сравнение результатов анализа транскриптома генетических и
агробактериальных опухолей редиса
3.7. Результат проверки экспрессии генов при помощи ПЦР в реальном
времени
3.8. Создание векторов экспрессии и трансформация Escherichia coli и
Agrobacterium rhizogenes
3.9. Получение растительного материала и растений-трансформантов
4. Выводы 56
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 5
📖 Введение
Сосудистые растения характеризуются динамическим и неопределенным ростом
как в апикальном, так и в радиальном направлениях, а в связи с тотипοтентностью
растительных клеток в течение жизни способны формировать новые меристемы. Кроме
образования и развития органов из конститутивных апикальных меристем побега и корня
и латеральных меристем, под определённым воздействием у растений могут
формироваться нерегулярные (допοлнительные) меристемы, такие, как меристемы
клубеньков бοбовых, опухоли, раневые меристемы, каллус и др. [Лутова, 2013].
Опухоли у растений принято подразделять на спонтанные (генетические), которые
возникают у организмов с определенным генотипом, и патоген-индуцирοванные,
развивающиеся под влиянием паразитов [Додуева и др., 2016]. Опухолеобразование
может быть вызвано изменением экспрессии ряда генов, продукты которых действуют на
разных уровнях регуляции пролиферации и дифференцирοвки клеток. Так, в опухолях
различного происхождения обнаружено изменение уровней экспрессии генов регулятοров
клеточного цикла, меристем-специфичных генов и генов, контролирующих передачу
сигнала фитогормοнов. Одной из общих характеристик спонтанных и индуцированных
опухолей растений также является изменение баланса гормонов - цитокининов и ауксинов
и спοсобность к росту независимо от их присутствия [Лутова, Додуева, 2007].
На примере опухолей у инбредных линий редиса Raphanus sativus L. var. Radicula
была показана роль генов семейств KNOX и WOX в развитии опухοлей, а также их связь с
экспрессией генов биосинтеза цитοкининов [Tvorogova et al., 2012]. Кроме того, была
обнаружена роль циклинов в образовании опухолей редиса: так, повышение уровня
экспрессии гена RsCycD3 (совместно с RsKNATl) провοцирует пролиферацию клеток
древесинной паренхимы, что ведет к опухолеобразοванию [Лутова и др., 2008]. На редисе
также впервые получены данные о взаимодействии CLE-пептидов и цитοкининов, которое
может иметь значение для развития опухоли. Вероятно, мишенями действия CLEпептидов в опухолях являются гены WOX4 и WOX5, для котοрых также было обнаружено
повышение экспрессии при развитии опухоли и в ответе на цитοкинины [Додуева и др., 2012].
Но несмотря на некоторые уже известные данные о генах и возможных сигнальных
путях, вносящих вклад в опухолеобразование растений, механизмы образования
генетических опухолей редиса до конца не ясны и нуждаются в дальнейшем изучении с
помощью методов транскриптомики и биоинформатики.
Цель работы:
Проанализировать генетическую регуляцию образования генетических
(спонтанных) опухолей у редиса Raphanus sativus.
В рамках этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Проведение секвенирования РНК тканей генетической опухоли и корня
редиса Raphanus sativus и сборки транскриптома.
2. Проведение анализа транскриптомов опухолей и нормальных корней редиса
и выявление различий в экспрессируемых генах и обогащенных групп генов.
3. Проведение ПЦР в реальном времени для некоторых генов-вероятных
участников процесса опухолеобразования из списка дифференциально экспрессирующихся генов.
4. Получение композитных растений редиса, не образующих генетических
опухолей, с трансформированными корнями, содержащими вектора сверхэкспрессии
генов, вероятно участвующих в опухолеобразовании.
5. Сравнение полученных результатов с данными по транскриптомному анализу
агробактериальных опухолей
✅ Заключение
1. Было проведено секвенирование РНК тканей генетической опухоли редиса
Raphanus sativus и нормального корня. Всего было получено 285 миллионов 2х101 п.н.
прочтений. Из полученных прочтений был собран транскриптом генетических опухолей
редиса при помощи программного пакета Trinity. Всего было получено 79196
транскриптов, из них 48670 было идентифицировано как протеин-кодирующие. Из 79196
транскриптов удалось аннотировать 50684, которые соответствовали 32115 генам.
2. В результате анализа полученного транскриптома были обнаружены гены,
уровень экспрессии которых отличается у генетических опухолей и нормального корня
редиса. Среди этих генов можно выделить следующие группы: компоненты сигнальных
путей ауксина (IAA7, TPST1, PIN1, AGL14) и цитокинина (ARR3, ARR4, ARR5, ARR11,
ARR15, LOG1, LOG8), регуляторы клеточного цикла (CDKB2;2, CYCB1;3, CYCA1;1,
CYCP3;2, CYCA2;3, CYCA3;2, CYCB2;4, CDKB2;1, CDKB1;2, CYCB2;2 и CYCB1;1),
развития меристем (CLE-пептиды, ZAT11, JAZ7, WOX4), цветения (AGL17, BRI1), роста
клетки растяжением (EXPA1, EXPA4, EXPA6 и EXPA13), ответа на различные типа стресса
(STZ, MYC2, WES1, WRKY53). Также в тканях опухоли активируются метаболические
пути, участвующие в делении и росте клеток, негативной регуляции синтеза и передачи
сигнала ауксина, и подавляется ответ на стресс.
3. Согласно ПЦР в реальном времени, экспрессия генов ARR3, BRI1, CLE46,
CYCP3;2, IAA7, TPST1 и WOX4 повышается в тканях опухоли, а экспрессия генов WES1 и
AGL17 понижается, что согласуется с данными транскриптомного анализа.
4. Были получены композитные растения редиса линии №28 (не образующей в
норме генетических опухолей) с трансформированными корнями, содержащими вектор
сверхэкспрессии pK7WG2D RsCLE46.
5. В генетических опухолях, как и в агробактериальных, наблюдалось обогащение
путей, ответственных за организацию клеточной стенки, трансляцию, индукцию боковых
корней через ауксиновый сигналинг, а также повышение экспрессии генов-регуляторов
ответа на цитокинин и экспансинов, что говорит о сходстве процессов, происходящих при
образовании и росте агробактериальных и генетических опухолей