Тип работы:
 Предмет:
 Язык работы:


Разработка ПЦР-системы для определения уровней экспрессии интерферонов мыши

Работа №138036

Тип работы

Дипломные работы, ВКР

Предмет

биология

Объем работы44
Год сдачи2018
Стоимость4250 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
9
Не подходит работа?

Узнай цену на написание



1. Введение4
2. Обзор литературы
2.1 Система интерферонов
2.2 Интерфероны первого типа(IFN I)
2.2.1 Особенности интерферонов первого типа
2.2.2 Активация транскрипции
2.2.3 Регуляция транскрипции
2.2.4 Действие интерферонов первого типа на клетку
2.3 Интерфероны второго типа (IFN II)
2.3.1 Особенности интерферонов второго типа.
2.3.2 Активация транскрипции
2.3.3 Регуляция транскрипции
2.3.4 Действие интерферонов второго типа на клетку
2.4 Интерфероны третьего типа (IFN III)
2.4.1 Особенности интерферонов третьего типа
2.4.2 Активация транскрипции
2.4.3 Регуляция транскрипции
2.4.4 Действие интерферонов третьего типа на клетку
3. Материалы и методы
3.1 Материалы
3.1.1 Органы мыши линии BALB/c.
3.1.2 Лимфоциты селезенки мыши BALB/c
3.2 Экстракция РНК
3.3 Обратная транскрипция
3.4 ПЦР в режиме реального времени
3.5 Разделение фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.....23
4. Результаты и обсуждение
4.1 Дизайн праймеров и зондов
4.2 Проверка качества выделенной тотальной РНК из органов мыши ..............26
4.3 Тестирование праймеров на специфичность
4.4 Проверка зондов и праймеров на чувствительность и специфичность в
моноплексном анализе
4.5 Оптимизация условий проведения мультиплексной ПЦР для определения
уровней экспрессии интерферонов мыши
5. Заключение
6. Основные выводы
7. Список литературы..

Интерфероны – группа сигнальных белков, являющихся главнейшим гуморальным
фактором экстренной неспецифической защиты (т.е. врожденного иммунитета) (Ank et al.,
2006). Интерфероны секретируются различными типами клеток и участвуют в регуляции
иммунного ответа в качестве антивирусных агентов широкого спектра действия.
На сегодняшний день описано свыше 300 различных эффектов интерферонов,
включающих подавление роста внутриклеточных и внеклеточных инфекционных агентов
вирусной и невирусной природы; антипролиферативную активность; индукцию
противоопухолевого ответа; подавление или усиление продукции антител; стимуляцию
макрофагов; усиление фагоцитоза; активацию цитотоксического действия
сенсибилизированных лимфоцитов на клетки-мишени; активацию натуральных киллеров;
стимуляцию освобождения гистамина базофилами; индукцию синтеза простагландина Е;
усиление презентации по механизму MHC I и II классов; усиление или ингибирование
активностей ряда клеточных ферментов; усиление цитотоксического действия
двухнитевых РНК; подавление гиперчувствительности замедленного типа; стимуляцию
выработки молекул адгезии (Ершов Ф.И., 2012).
Такое многообразие физиологических функций позволяет рассматривать
интерфероны как отдельное звено – систему интерферонов, выполняющую контрольнорегулирующую роль в сохранении гомеостаза. Экспрессия генов интерферонов в
основном не является конститутивной, а индуцируется в клетке в ответ на внедрение
вирусов и бактерий (или их продуктов). Изучение уровней экспрессии генов, относящихся
к системе интерферонов, позволит, например, исследовать состоятельность иммунного
ответа при инфицировании вирусами, оценить иммуногенность и реактогенность
вакцинных препаратов, проследить формирование специфического клеточноопосредованного ответа. Таким образом, разработка ПЦР-системы для детекции
интерферонов мыши на уровне транскрипции является актуальной задачей, позволяющей
расширить методы молекулярной диагностики интерферонов, в настоящее время
преимущественно ограниченной ИФА.
Цель исследования состояла в создании ПЦР-системы, позволяющей достоверно
оценивать уровни экспрессии генов интерферонов в организме мыши.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1) Провести дизайн праймеров и зондов, специфически выявляющих интерферональфа, интерферон-бета, интерферон-гамма и интерферон-лямбда в организме мыши;
2) Выделить препараты тотальной РНК из органов мыши без примеси ДНК;
3) Получить препараты кДНК из органов мыши для отработки условий ПЦР;
4) Проверить специфичность подобранных праймеров и зондов;
5) Оценить эффективность амплификации специфических мишеней в моноплексном и мультиплексном форматах ПЦР

Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

В процессе выполнения представленного научного исследования была разработана
система для количественной оценки интерферонов мыши на основе мультиплексной ПЦР
с детекцией в режиме реального времени. Разработанная система состоит из четырех
наборов реакций, каждый из которых позволяет количественно выявлять мРНК одного из
четырех интерферонов-мишеней (IFNα, IFNβ, IFNγ или IFNλ) и мРНК гена GAPDH –
эндогенного контроля, используемого для нормализации. Параллельное определение
сразу двух мишеней (одного из интерферонов и гена-референса) в одной реакции
повышает точность разработанной ПЦР-системы. Подобный дизайн ПЦР-системы также
позволяет уменьшить расход образца и добиться воспроизводимых результатов.
С использованием программы Vector NTI Advance 11 был проведен дизайн
праймеров и олигонуклеотидных зондов, специфически выявляющих интерфероны мыши.
Для IFNγ и IFNλ были подобраны праймеры, позволяющие детерминировать геномную
ДНК и кДНК. Зонды и праймеры для IFNλ позволяют одновременно детектировать два
транскрипционных варианта гена. Для определения экспрессии IFNα были разработаны
вырожденные праймеры и два олигонуклеотидных зонда, одновременно выявляющие 14
существующих у мыши субтипов интерферонов.
Специфичность полученных праймеров была подтверждена методом ПЦР с
последующей детекцией продуктов методом электрофоретического разделения в
агарозном геле. Все подобранные праймеры образуют целевой, предсказанный in silico
продукт, без образования димеров праймеров и зонда.
Были оптимизированы соотношения праймеров для каждой мишени, а также
рассчитаны эффективности амплификации специфических продуктов с использованием
серии последовательных десятикратных разведений кДНК. Рассчитанные эффективности
амплификации свыше 95 % и отличаются друг от друга в каждом наборе реакций не более чем на 5 %.
При выполнении дипломной работы были освоены такие основные методы,
используемые в молекулярно-биологической лаборатории, как выделение лимфоцитарной
фракции из селезенки мыши, экстракция препаратов тотальной РНК из органов мыши,
электрофоретическое разделение РНК в агарозном геле, получение кДНК методом
обратной транскрипции, постановка ПЦР с детекцией в режиме реального времени,
электрофоретическое разделение продуктов ПЦР. Получены навыки дизайна праймеров и
олигонуклеотидных Taq-Man зондов.
В заключение следует отметить, что хотя предложенная ПЦР-система изначально
была разработана для определения уровней экспрессии интерферонов в организме мыши
при гриппе, она может быть применена при проведении более широкого круга
биологических исследований, проводимых с использованием этой животной модели.
В дальнейшем планируется продолжить представленную выпускную
квалификационную работу и с использованием разработанной ПЦР-системы сравнить
уровни экспрессии интерферонов в легких, селезенке и печени инфицированных и интактных мышей


Ank, N., West, H., and Paludan, D.S.R. (2006). IFN-λ: Novel Antiviral Cytokines. J.
Interferon Cytokine Res. 379, 373–379.
Barton, K., Muthusamy, N., Chanyangam, M., Fischer, C., Clendenin, C., and Leiden,
J.M. (1996). Defective thymocyte proliferation and IL-2 production in transgenic mice
expressing a dominant-negative form of CREB. Nature 379, 81–85.
Boehm, U., Klamp, T., Groot, M., and Howard, J.C. (1997). Cellular responses to
interferon-gamma . Annu. Rev. Immunol. 15, 749–795.
Bouma, G., and Strober, W. (2003). The immunological and genetic basis of
inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521–533.
Castranova, V., Asgharian, B., Sayre, P., Virginia, W., and Carolina, N. (2016).
Interferons and viruses an evolutionary arms race of molecular. 36, 1922–2013.
Coccia, E.M., Severa, M., Giacomini, E., Monneron, D., Remoli, M.E., Julkunen, I.,
Cella, M., Lande, R., and Uzé, G. (2004). Viral infection and Toll-like receptor agonists induce a
differential expression of type I and lambda interferons in human plasmacytoid and monocytederived dendritic cells. Eur. J. Immunol. 34, 796–805.
Cohen, B., Novick, D., Barak, S., and Rubinstein, M. (1995). Ligand-induced association
of the type I interferon receptor components. Mol. Cell. Biol. 15, 4208–4214.
Der, S.D., Zhou, A., Williams, B.R.G., and Silverman, R.H. (1998). Identification of
genes differentially regulated by interferon alpha, beta, or gamma using oligonucleotide arrays.
Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 15623–15628.
Easlick, J., Szubin, R., Lantz, S., Baumgarth, N., and Abel, K. (2010). The early
interferon alpha subtype response in infant macaques infected orally with SIV. J. Acquir.
Immune Defic. Syndr. 55, 14–28.
Fasler-Kan, E., Pansky, A., Wiederkehr, M., Battegay, M., and Heim, M.H. (1998).
Interferon-alpha activates signal transducers and activators of transcription 5 and 6 in Daudi
cells. Eur J Biochem 254, 514–519.
Filipe-Santos, O., Bustamante, J., Chapgier, A., Vogt, G., de Beaucoudrey, L., Feinberg,
J., Jouanguy, E., Boisson-Dupuis, S., Fieschi, C., Picard, C., et al. (2006). Inborn errors of IL-
12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin.
Immunol. 18, 347–361.
García-Sastre, A. (2011). Induction and evasion of type I interferon responses by
influenza viruses. Virus Res. 162, 12–18.
González-Navajas, J.M., Lee, J., David, M., and Raz, E. (2012). Immunomodulatory
functions of type i interferons. Nat. Rev. Immunol. 12, 125–135.
Grogan, J.L., and Locksley, R.M. (2002). T helper cell differentiation: On again, off
again. Curr. Opin. Immunol. 14, 366–372.
Hillyer, P., Mane, V.P., Schramm, L.M., Puig, M., Verthelyi, D., Chen, A., Zhao, Z.,
Navarro, M.B., Kirschman, K.D., Bykadi, S., et al. (2012). Expression profiles of human42
interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunol. Cell
Biol. 90, 774–783.
Hiscott, J., Nguyen, T.L.A., Arguello, M., Nakhaei, P., and Paz, S. (2006). Manipulation
of the nuclear factor-κB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene 25,
6844–6867.
Horvath, C.M. (2004). The Jak-STAT pathway stimulated by interferon gamma. Sci.
STKE 2004, tr8.
Hu, X., and Ivashkiv, L.B. (2009). Cross-regulation of Signaling Pathways by Interferon-
γ: Implications for Immune Responses and Autoimmune Diseases. Immunity 31, 539–550.
Ivashkiv, L.B., and Donlin, L.T. (2013). Regulation of type I interferon responses. Nat.
Rev. Immunol. 14, 36–49.
Iversen, M.B., Ank, N., Melchjorsen, J., and Paludan, S.R. (2010). Expression of Type III
Interferon (IFN) in the Vaginal Mucosa Is Mediated Primarily by Dendritic Cells and Displays
Stronger Dependence on NF- B than Type I IFNs. J. Virol. 84, 4579–4586.
Kawai, T., Sato, S., Ishii, K.J., Coban, C., Hemmi, H., Yamamoto, M., Terai, K.,
Matsuda, M., Inoue, J.I., Uematsu, S., et al. (2004). Interferon-α induction through Toll-like
receptors involves a direct interaction of IRF7 with MyD88 and TRAF6. Nat. Immunol. 5, 1061–
1068.
Kotenko, S. V., and Donnelly, R.P. (2006). Type III Interferons: The Interferon-λ Family.
In The Interferons: Characterization and Application, pp. 141–163.
Kuo, C.T., and Leiden, J.M. (1999). Transcriptional regulation of T lymphocyte
development and function. Annu. Rev. Immunol. 17, 149–187.
Lazear, H.M., Nice, T.J., and Diamond, M.S. (2015). Interferon-λ: Immune Functions at
Barrier Surfaces and Beyond. Immunity 43, 15–28.
Li, M., Liu, X., Zhou, Y., and Su, S.B. (2009). Interferon- s: the modulators of antivirus,
antitumor, and immune responses. J. Leukoc. Biol. 86, 23–32.
Lieberman, L.A., Banica, M., Reiner, S.L., and Hunter, C.A. (2004). STAT1 Plays a
Critical Role in the Regulation of Antimicrobial Effector Mechanisms, but Not in the
Development of Th1-Type Responses during Toxoplasmosis. J. Immunol. 172, 457–463.
Liu, L., Botos, I., Wang, Y., Leonard, J.N., Shiloach, J., Segal, D.M., and Davies, D.R.
(2008). Structural basis of toll-like receptor 3 signaling with double-stranded RNA. Science 320,
379–381.
Murphy, K., and Weaver, C. (2017). JANEWAY.
Negishi, H., Taniguchi, T., and Yanai, H. (2017). The Interferon (IFN) Class of
Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harb.
Perspect. Biol. a028423.
Nolan, T., Hands, R.E., and Bustin, S.A. (2006). Quantification of mRNA using real-time
RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559–1582.
Osterlund, P.I., Pietilä, T.E., Veckman, V., Kotenko, S. V, and Julkunen, I. (2007). IFN
regulatory factor family members differentially regulate the expression of type III IFN (IFN43
lambda) genes. J. Immunol. 179, 3434–3442.
Pearce, E.L., Mullen, A.C., Martins, G.A., Krawczyk, C.M., Hutchins, A.S., Zediak,
V.P., Banica, M., DiCioccio, C.B., Gross, D.A., Mao, C., et al. (2003). Control of Effector CD8+
T Cell Function by the Transcription Factor Eomesodermin. Science (80-. ). 302, 1041 LP-1043.
Penix, L.A., Sweetser, M.T., Weaver, W.M., Hoeffler, J.P., Kerppola, T.K., and Wilson,
C.B. (1996). The proximal regulatory element of the interferon-gamma promoter mediates
selective expression in T cells. J Biol Chem 271, 31964–31972.
Pestka, S. (2007). The interferons: 50 Years after their discovery, there is much more to
learn. J. Biol. Chem. 282, 20047–20051.
Piehler, J., Thomas, C., Christopher Garcia, K., and Schreiber, G. (2012). Structural and
dynamic determinants of type I interferon receptor assembly and their functional interpretation.
Immunol. Rev. 250, 317–334.
Poynter, S.J., and DeWitte-Orr, S.J. (2016). Fish interferon-stimulated genes: The
antiviral effectors. Dev. Comp. Immunol. 65, 218–225.
Rosenzweig, S.D., and Holland, S.M. (2005). Defects in the interferon-gamma and
interleukin-12 pathways. Immunol. Rev. 203, 38–47.
Sada-Ovalle, I., Chiba, A., Gonzales, A., Brenner, M.B., and Behar, S.M. (2008). Innate
invariant NKT cells recognize Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages, produce
interferon-γ, and kill intracellular bacteria. PLoS Pathog. 4.
Sadler, A.J., and Williams, B.R.G. (2008). Interferon-inducible antiviral effectors. Nat.
Rev. Immunol. 8, 559–568.
Schoenborn, J.R., and Wilson, C.B. (2007). Regulation of interferon-gamma during
innate and adaptive immune responses. Adv. Immunol. 96, 41–101.
Skurkovich, B., and Skurkovich, S. (2003). Anti-interferon-gamma antibodies in the
treatment of autoimmune diseases. Curr. Opin. Mol. Ther. 5, 52–57.
Szubin, R., Chang, W.L.W., Greasby, T., Beckett, L., and Baumgarth, N. (2008). Rigid
interferon-alpha subtype responses of human plasmacytoid dendritic cells. J. Interferon Cytokine
Res. 28, 749–763.
Takeuchi, O., and Akira, S. (2010). Pattern Recognition Receptors and Inflammation.
Cell 140, 805–820.
Thomas, C., Moraga, I., Levin, D., Krutzik, P.O., Podoplelova, Y., Trejo, A., Lee, C.,
Yarden, G., Vleck, S.E., Glenn, J.S., et al. (2011). Structural linkage between ligand
discrimination and receptor activation by Type i interferons. Cell 146, 621–632.
Ullah, M.O., Sweet, M.J., Mansell, A., Kellie, S., and Kobe, B. (2016). TRIF-dependent
TLR signaling, its functions in host defense and inflammation, and its potential as a therapeutic
target. J. Leukoc. Biol. 100, 27–45.
Woelk, C.H., Frost, S.D.W., Richman, D.D., Prentice, E., and Pond, S.L.K. (2008).
Evolution of the interferon alpha gene family in eutherian mammals. Gene 397, 38–50.
Zhang, X., Brann, T.W., Zhou, M., Yang, J., Oguariri, R.M., Lidie, K.B., Imamichi, H.,
Huang, D.-W., Lempicki, R.A., Baseler, M.W., et al. (2011). Cutting Edge: Ku70 Is a Novel44
Cytosolic DNA Sensor That Induces Type III Rather Than Type I IFN. J. Immunol. 186, 4541–
4545.
Zitvogel, L., Galluzzi, L., Kepp, O., Smyth, M.J., and Kroemer, G. (2015). Type I
interferons in anticancer immunity. Nat. Rev. Immunol. 15, 405–414.
Ершов.Ф.И. (2012). Интерферон.

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.



Подобные работы


©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.