СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. Обзор литературы 6
1.1. Система комплемента 6
1.1.1. История изучения системы комплемента 7
1.1.2. Пути активации системы комплемента 8
1.1.3. Регуляция работы системы комплемента 11
1.1.3.1 Естественные регуляторы системы комплемента 11
1.1.3.2. Природные и искусственные ингибиторы системы комплемента 14
1.1.4. Другие биологические функции комплемента 15
1.1.4.1. Участие компонентов комплемента в реакциях местного воспаления 15
1.1.4.2. Прямая антимикробная активность компонентов системы комплемента 16
1.2. Антимикробные пептиды 16
1.2.1. История открытия антимикробных пептидов 17
1.2.2. Классификация антимикробных пептидов и их структурные свойства 17
1.2.2.1. Классификация по организму-хозяину 17
1.2.2.2. Классификация по механизму синтеза. 18
1.2.2.3. Классификация по структурным свойствам 19
1.2.2.4. Классификация по трёхмерной структуре 20
1.2.2.5. Классификация на основе молекулярных мишеней антимикробного пептида 21
1.2.2.6. Классификация на основе паттернов ковалентного связывания 21
1.2.2.7. Классификация по функции пептида 22
1.2.3. Механизм действия антимикробных пептидов 22
ГЛАВА 2. Материалы и методы 25
2.1. Синтез C3f 25
2.1.1. Конденсация аминокислот на полимерном носителе 25
2.1.2. Отщепление пептида от полимерного носителя 29
2.2. Очистка C3f методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) 29
2.3. Анализ полученных фракций 30
2.3.1. Обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ) 30
2.3.2. Измерение концентрации C3f 30
2.3.3. Масс-спектрометрия 31
2.4. Анализ антимикробной активности пептида методом радиальной диффузии 31
ГЛАВА 3. Результаты 33
3.1. Получение пептида C3f 33
3.1.1. Твердофазный синтез 33
3.1.2. Очистка C3f методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 33
3.2. Исследование антимикробной активности C3f 36
ГЛАВА 4. Обсуждение 42
ВЫВОДЫ 44
БЛАГОДАРНОСТИ 45
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 46
Развитие резистентности микроорганизмов к используемым в терапевтических целях антибиотическим веществам является серьёзной проблемой при лечении инфекционных заболеваний бактериальной и грибковой природы[67]. Одним из вариантов решения данной проблемы является поиск веществ, имеющих альтернативные механизмы действия для осуществления бактерицидной функции. Наибольший интерес вызывают механизмы, реализуемые врождённым иммунитетом, а именно его гуморальным компонентом, к которому относятся антимикробные пептиды[46], система комплемента[6], липополисахарид-связывающие белки, белки острой фазы воспаления.
Антимикробные пептиды — гетерогенная группа преимущественно низкомолекулярных молекул, характеризующихся такими свойствами как катионность и амфипатичность. Существуют два основных механизма их действия. Первый основан на их деструктивном воздействии на плазматическую мембрану микроорганизма, путём образования пор, истончения мембраны или изменения её пластичности. Во втором варианте разрушения плазматической мембраны не происходит, антимикробный пептид воздействует на внутриклеточные мишени микроорганизма[74].
Другим мощным инструментом врождённого гуморального иммунитета является система комплемента, представляющая собой совокупность из 9 основных белков (C1-C9) и многочисленных продуктов активации каскада. Активация может идти по трём путям: классическому, альтернативному и лектиновому, в результате которой происходит формирование мембран-атакующего комплекса (МАК) на поверхности патогенной клетки с последующим её лизисом, или опсонизация клетки микроба с дальнейшим рецепторно-опосредованным фагоцитозом.
Центральным компонентом системы комплемента является белок C3, образующий при гидролизе свою активную форму – C3b, участвующую как в инициации сборки МАК, так и в опсонизации патогенных клеток. Помимо C3b, при гидролизе образуется компонент C3a, являющийся анафилотоксином. Дальнейший гидролиз компонента C3bприводит к образованию его инактивированной формыiC3bи компоненту C3f.
Помимо образования МАК некоторые компоненты системы комплемента имеют прямое антимикробное действие. Для C3aбыло показано, что данный пептид и его производные проявляют бактерицидные свойства и разрушают плазматическую мембрану бактерий[50].
C3f – пептид, состоящий из семнадцати аминокислотных остатков (SSKITHRIHWESASLLR),с молекулярной массой 2021,28 Да. При pH 7 молекула имеет заряд +2,2, что позволяет классифицировать C3f как катионный пептид. Показано, что компонент C3fспособен вызывать сокращения гладкомышечной ткани, то есть, обладает спазмогенным действием, как и анафилотоксинC3a[18].
На данный момент физиологическая роль компонента C3fне установлена[3].Катионные свойства этого пептида позволяют нам предполагать, что данный компонент системы комплемента, возможно, обладает прямым антимикробным действием.
Эндогенные антимикробные пептиды и белки могут быть использованы в качестве прототипов новых лекарственных препаратов, обладающих антимикробной активностью, что делает исследования в данном направлении актуальными.
Цель выпускной квалификационной работы — изучение биологической активности пептида C3f.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Получить компонент C3f методом твердофазного синтеза пептидов.
2. Провести очистку синтезированного пептидапосредством обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ).
3. Оценить чистоту полученного пептида методом ОФ ВЭЖХ и соответствие молекулярной массе методом MALDI/TOF масс-спектрометрии.
4. Изучить антимикробную активность C3f.
1. Методом твердофазного синтеза по Fmoc/tBu-стратегии был получен C3f.После очистки методом высокоэффективной жидкостной хроматографии был получен пептидC3fс конечным выходом 19,7 %и чистотой 98,0 %.
2. Соответствие молекулярной массы синтезированного пептида массеC3f было подтверждено масс-спектрометрическим анализом. Молекулярная масса пептида составила 2022 Да.
3. Показано, что пептид C3f обладает антимикробной активностью invitroв отношении грамположительной бактерииListeriamonocytogenes(МИК около 70мкмоль/л). Также, C3fпоказал ингибирующее действие в отношении грамположительных бактерийMicrococcusluteus(МИК около 161мкмоль/л) иEnterococcusfaecium(МИК более 128 мкмоль/л).
4. Показано, что пептид C3f не активен invitroв отношении микроорганизмов:Candidaalbicans, Escherichiacoli, Bacilluscereus.
