СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Взаимодействия микроорганизмов 7
1.1.1. Биопленки микроорганизмов 14
1.1.2. Понятие о Quorumsensing 16
1.2. Проблема лекарственной устойчивости 20
1.2.1. Механизмы формирования антибиотикорезистентности 22
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 25
2.1. Объекты исследования 25
2.1.1. Micrococcus luteus 25
2.1.2. Staphylococcusaureus 26
2.1.3. Группы используемых антимикробных препаратов 28
2.2. Методы исследования 34
2.2.1. Определение биосовместимости клеток S. aureus 4, S. aureus 6, M. luteus 1 35
2.2.2. Определение антибиотикочувствительности методом дисков 37
2.5. Статистическая обработка результатов 37
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
3.1. Определение биосовместимости клеток S. aureus 4, S. aureus 6, M. luteus 1 39
3.2. Определение антибиотикочувствительности S. aureus 4, S. aureus 6, M. luteus 1 методом дисков 47
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 51
ВЫВОДЫ 55
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 56
ПРИЛОЖЕНИЯ 69
БЛАГОДАРНОСТИ 70
Актуальность. Внедрение в медицинскую практику таких лекарственных средств как антибиотики было настоящей революцией в лечении инфекционных заболеваний [10]. Однако в настоящее время резкое увеличение бактериальной резистентности к антимикробным препаратам(АМП) затрудняет проведение эффективной терапии и стимулирует поиск альтернативной противомикробной терапии[54,23]. «Мир вступает в эпоху, когда антибиотики теряют эффективность, и обычные инфекции и небольшие травмы, которые можно было излечивать в течение многих десятилетий, сейчас могут снова убивать», — говорит помощник Генерального директора ВОЗ по безопасности здравоохранения доктор Keiji Fukuda[54,105].В докладе Всемирной организации здравоохранения «Устойчивость к противомикробным препаратам: глобальный доклад по эпиднадзору» подчеркивается, что эта очень важная проблема существует уже сейчас и является серьезной угрозой для человечества [54].
Устойчивость к АМП приводит к тому, что люди болеют, в течение более длительного времени, и вероятность смертельного исхода повышается. Так, по оценкам, вероятность смерти людей, инфицированных MRSA (метициллин-устойчивые бактерии Staphylococcus aureus) на 64% выше, по сравнению с людьми с лекарственно-неустойчивой формой инфекции. Устойчивость также приводит к увеличению расходов на медицинскую помощь в результате более длительного пребывания в стационарах и предполагает необходимость более интенсивного лечения [105].
Одним из возможных решений данной проблемы может быть изучение вопроса межвидовых взаимодействий бактерий. «Бактерии давно тренировались в «локальных войнах» между собой – задолго до появления человека, и уже попробовали всё, что только возможно. Поэтому у нас совершенно нет шансов на изобретение некой одной «золотой пули» в борьбе с инфекцией»[103]. Необходимо более глубоко подойти к изучению этого вопроса. Поэтому выявление новых антибактериальных эффектов бактериальных культур поможет понять молекулярные механизмы регуляции межклеточных коммуникаций в микробных сообществ на клеточном и популяционном уровнях.
За почти 80-летний период существования науки об АМП неоднократно менялись основные направления исследований в области изыскания новых антибиотиков[4]. Стоит отметить, что наличие у антибиотиков побочных эффектов, таких как цитотоксичность, подавление нормальной микробиоты, возможность возникновения аллергических и аутоиммунных заболеваний, также может накладывать ограничение на изобретение новых химических молекул и использование данных препаратов [5, 53]. Все это подталкивает на поиск новых подходов и схем лечения инфекционных заболеваний [23, 34]. Одним из возможных решений данной проблемы может быть использование бактериоцинов в рамках альтернативной или комбинированной антимикробной терапии [47, 15].
Бактериоцины относятся к большому семейству секретируемых некоторыми бактериями пептидов, обладающих антимикробной активностью против бактерий близкородственных видов и родов[50]. Одним из постоянных источников продукции бактериоцинов являются бактерии нормальной микробиоты, играющие существенную роль в жизнедеятельности человека[13].
Микробиота представляет собой эволюционно сложившееся сообщество микроорганизмов, населяющих открытые полости, слизистые оболочки и кожу человека, определяющее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие организма-хозяина [87]. Микробиотаформирует барьер колонизационной резистентности, ограничивая контаминацию слизистых оболочек патогенными и нерезидентными условно патогенными микроорганизмами, участвует в стимуляции лимфоидной ткани, витаминообразовании и др. [40].В настоящее время популярна теория, так называемого «совместного иммунитета», которая полагает, что макроорганизм может быть защищен как собственной иммунной системой, так и компонентами его нормальной микробиоты [13].
Стоит отметить, что синтез бактериоцинов представителями нормальной микробиоты позволяет бактериям «общаться», координировать свои действия и синхронизировать групповое поведение за счет секреции диффундирующих сигнальных молекул [20].
Целью данной работы было определение влияния межвидовых взаимодействий представителей нормобиоты (Staphylococcus aureus и Micrococcus luteus) на их чувствительность к антимикробным препаратам.
Задачи исследования
• Оценить изменение ростовых свойств суспензионных (планктонных) форм клетокS. aureus 4, S. aureus 6 и M. luteus1 и процесса биопленокообразования при добавлении супернатантов чужеродных кокков.
• Провести анализ биосовместимости и установить характер взаимоотношений между представителями нормобиоты S. aureus 4, S. aureus 6 и M. luteus.
• Провести исследование влияния супернатантов S. aureus 4, S. aureus 6 и M. luteus на их чувствительность к антимикробным препаратам.
Снижение эффективности антимикробных препаратов при лечении инфекционных заболеваний является одной из важнейших проблем современной медицины. По примерным подсчетам ежегодно умирает около 700 тысяч человек от инфекций, вызванных антибиотикорезистентными патогенными и условно патогенными бактериями [91].
Одним из способов решения данной проблемы является изыскание наиболее действенных методов с применением новых эффективных природных антибиотиков. В настоящее время научные исследования направлены, как на поиск продуцентов новых антибиотиков, так и на изучение неисследованных ранее аспектов антимикробной активности «старых-новых» антимикробных веществ или улучшение их свойств. Наибольшее внимание привлекают продукты микробной жизнедеятельности –бактериоцины. Эти, как правило, низкомолекулярные белки бактериальной при также роды активно используют в качестве консервирующих веществ в пищевой промышленности для предотвращения порчи изготавливаемых продуктов сапрофитными микроорганизмами. Бактериоцины, возможно, также можно будет применять в комбинации с уже известными антимикробными препаратами. В настоящее время значительный интерес представляют не только сами бактериоцины, но и продуцирующие их бактериальные штаммы, которые также могут быть использованы в пищевой и фармацевтической промышленности в составе стартовых культур и приготовления пробиотических препаратов. Способность микроорганизмов проявлять антагонистическую активность к патогенным бактериям является одним из определяющих свойств при выборе пробиотических штаммов [106].
Целью данной работы было определение влияния межвидовых взаимодействий представителей нормобиоты кожных покровов (S. aureus 4, S. aureus 6, M. luteus 1) на их чувствительность к антимикробным препаратам. Представлялось важным проанализировать характер взаимоотношений между бактериями в эволюционно сложившемся микробном сообществе на примере нормобиоты кожи – биотопа, наиболее подверженного воздействию негативных факторов окружающей среды, в том числе различных АМП и дезинфектантов.
В своих работах Семенов А. В. [67], Бухарин О. В. [64] рассматривают антагонизм, как один из основных типов симбиотических отношений бактерий в составе микробиоты, считая, совместное культивирование бактерий наиболее важным условием проявления антагонизма и продукции антимикробных веществ, что нельзя обнаружить при раздельном культивировании микроорганизмов. В исследованиях Г. Шиллер и Н. Макаровской [65] высказано предположение о зависимости проявлений антагонизма от чувствительности тест-культур и о возможной генетической «памяти» микроорганизмов, в отношении которых проявляется антагонизм.
Предположение данных авторов нашли подтверждение в настоящей работе. Установлено, что представители нормобиоты кожи, такие какM. luteus1, S. aureus 4 и , S. aureus 6, проявляли различную степень выраженности антагонистического отношения друг к другу. Так например, добавление супернатантов M. luteus1 и S. aureus 4 снижало численность планктонных (суспензионных) форм клеток и усиливалоактивность процесса биопленкообразования клетками S. aureus 6.
Напротив, при добавлении супернатанта S. aureus 6происходило стимулирование роста суспензионных (планктонных) форм обеих культур M. luteus1 и S. aureus 4, что практически не влияло на их способность к биопленкообразованию.
Интенсивное биопленкообразование клеток S. aureus 6 при добавлении супернатантов культурM. luteus1 и S. aureus 4, в состав которых входят бактериоциноподобные субстанции, подтверждает активацию планктонных форм клеток, способных адгезироваться к поверхностям плотной питательной среды и формировать биоплёночную форму микробных сообществ, характеризующуюся повышенной устойчивостью, поскольку в ее состав входят защитные структуры, препятствующие антагонистическому воздействию чужеродных микроорганизмов.
В литературе большое внимание уделяется вопросам создания комбинированных лекарственных форм с бактериоцинами на основе известных антимикробных препаратов, в частности с бактериоцинами энтерококков. При создании комбинированных вариантов препаратов из этих веществ отмечена особая важность учета молекулярных масс антимикробных препаратов, так и необходимость контроля за постоянством временного и температурного режимов [67, 107].
В этой связи большой интерес представляет изучение вопроса о возможности создания и применения комплексных лекарственных препаратов на основе бактериоцинов микрококков. Известно, что микрококки, как одни из наиболее значимых представителей нормобиоты кожи, долгое время сосуществуют со стафилококками, проявляя к ним выраженный антагонизм. К сожалению, вплоть до настоящего времени данные литературы о бактериоцинах микрококков остаются достаточно скудными. Незаинтересованность в развитии данного научного направления, возможно, связана с экономическими проблемами, затрагивающими область косметологии.
Однако интерес к бактериоцинам микрококков поддерживают сообщения о выделении из них субстанций, способных ингибировать многие грамположительные бактерии, в том числе микобактерии туберкулеза, а также некоторые виды актиномицетов [108]. Автор ссылается на работы других его коллег, которые также отмечали антимикробное действие супернатанта микрококков. Выделенное вещество было растворимо в спирте и медленно инактивировалось при нагревании. Однако ни один автор не сообщил подробностей о штаммах микрококков, с которыми они работали.
Исследования, проведенные в представленной работе показали, что присутствие супернатанта M. luteus1 в плотной питательной среде, на которой выращивали стафилококки, повышало их чувствительность к антибиотикам. Так, добавление супернатантаM. luteus1 в сочетании с ципрофлоксацином повышало чувствительность клеток S. aureus 4 к данному АМП, что выражалось в увеличении зоны подавления их роста на 18 мм, а у клеток S. aureus 6 на 19 мм, по сравнению с контролем.
Аналогичные изменения наблюдали также при добавлении в ППС супернатантаM. luteus1, при этом сочетание с действием амоксициллина приводило к еще большему увеличению зоны подавления роста клеток S. aureus 4 - на 26 мм, по сравнению с контрольным образцом без супернатанта.
Полученные данные могут свидетельствовать не только о высокой антибактериальной активности супернатанта M. luteus1, но и расширять наши представления о возможностях использования микроорганизмов, входящих в состав нормобиоты кожных покровов, в борьбе с патогенными бактериями.
Наконец, информация о высокой антагонистической активности супернатантов M. luteus1является основой для увеличения с их помощью эффективности использования уже известных антибактериальных средств.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
