Участие белка теплового шока 70кДа в эпителиально-мезенхимальном переходе

Список сокращений ............................................................................................................................ 4
Введение .............................................................................................................................................. 5
Обзор литературы............................................................................................................................... 5
Глава 1. Эпителиально-мезенхимальный переход ................................................................ 6
1.1 Типы эпителиально мезенхимального перехода................................................................ 7
1.2 Маркеры эпителиально-мезенхимального перехода ......................................................... 8
Е (epithelial)-кадгерин ........................................................................................................... 9
N (neural)-кадгерин ............................................................................................................. 10
Виментин ............................................................................................................................... 11
Smad ....................................................................................................................................... 11
Snail (SnaiI), Slug (SnaiII) .................................................................................................... 12
Zeb1, Zeb2 .............................................................................................................................. 12
Twist1, Twist2 ........................................................................................................................ 13
Глава 2. Семейство белков теплового шока 70 кДА HSP70 ............................................... 13
2.1 Строение............................................................................................................................... 14
2.2 Функции HSP70 ................................................................................................................... 15
Стресс-индукция HSP70 ....................................................................................................... 15
АТФ-азный цикл .................................................................................................................... 15
2.3 HSP70 в опухолевых клетках ............................................................................................. 16
Внутриклеточный HSP70...................................................................................................... 16
Апоптоз ................................................................................................................................... 16
Физиологическое старение ................................................................................................... 17
Мембранный HSP70 .............................................................................................................. 17
Свободный HSP70 ................................................................................................................ 18
2.4 HSP70 в EMT ....................................................................................................................... 19
HSP70 в ЕМТ здоровых тканях и при фиброзе ................................................................. 19
HSP70 в Emt в опухолевых клетках..................................................................................... 20
Материалы и методы ........................................................................................................................ 21
1. Культивирование клеток ................................................................................................... 21
2. Бактериальная трансформация с помощью RbCl ........................................................ 22
3. Клеточная плазмидная трансфекция .............................................................................. 24
4. Лентивирусная трансдукция клеточной линии DLD1 с помощью полибрена ....... 24
5. Выделение РНК из клеточных лизатов........................................................................... 26
Получение кДНК с помощью обратной транскрипции ............................................... 26
Количесвенный ПЦР в реальном времени; ............................................................................ 26
7. SDS-PAGE электрофорез по Лэммли и Вестернблоттиг.............................................. 27
6. Тест оценки миграции (зарастание царапины)............................................................. 28
Результаты и обсуждения ......................................................................................................... 28
1. Получение клеточной линии DLD1 с пониженным содержанием HSP70 с
помощью лентивирусной трансдукции .................................................................................. 28
2. Получение клеточной линии DLD1 с повышенным содежанием snail с помощь
плазмидной трансфекции pcDNA3 Snail ................................................................................ 30
3. Количественная оценка уровня экспрессии Snail и Slug методом qPCR в
полученных сублиниях. ............................................................................................................. 31
Выводы .............................................................................................................................................. 34
Список литературы ........................................................................................................................... 34
Купить

Последние годы интерес к изучению процесса метастазирования растет, поскольку оно
является основной причиной высокой смертности при опухолевых заболеваниях
эпителиальных тканей.
Первым этапом процесса метастазирования является эпителиально-мезенхимальный переход,
в ходе которого эпителиальные клетки приобретают мезенхимальный фенотип, теряют
плотные и адгезионные межклеточные контакты, происходит перестройка цитоскелета,
позволяющая им активно перемещаться, а также они начинают синтезировать ферменты,
которые способны деградировать внеклеточный матрикс, что позволяет им проходить через
базальную мембрану и распространяться по сосудистому руслу в дистальные органы. В
инициации и элонгации ЕМТ задействованы различные молекулярные процессы.
Основной трудностью для эффективной противоопухолевой терапии без деструктивного
воздействия на здоровые ткани является высокоактивная цитопротекторная система в
опухолевых клетках. Одним из основных участников этой системы защиты является белок
теплового шока 70кДА (HSP70). Это многофункциональный стресс-индуцируемый белок,
повышенное количество которого в цитозоле клеток коррелирует с неблагоприятным
прогнозом для пациента.
Роль, HSP70 в ЕМТ остается малоизученной. Существуют данные о прямом блокировании
HSP70 процесса EMT, но все эти исследования касаются изучения EMT в аспекте заживления
ран, регенерации тканей и фиброза органов. С другой стороны, существуют исследования,
которые косвенно подтверждают, что HSP70 способен стимулировать EMT на моделях
метастазирующих опухолевых клеток.
Целью нашего исследования является изучение роли белка теплового шока HSP70 в
эпителиально-мезенхимальном переходе.
В рамках данной цели были поставлены следующие задачи:
∗ Получить клеточную линию с пониженной экспрессией HSP70
∗ Разработать клеточную модель EMT, основанную на трансфекции клеточной
линии DLD1 вектором с повышенной экспрессией SNAIL.
∗ Провести количественный анализ ЕМТ-маркеров Snail и Slug.
∗ Провести анализ миграционной характеристики клеток.
Купить