Список сокращений 4
Введение 5
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Введение 7
1.2. Структура поли(С)-связывающих белков 7
1.3. Разнообразие изоформ поли(С)-связывающих белков 9
1.4. Посттрансляционные модификации 10
1.5. Локализация поли(С)-связывающих белков 10
1.6. Функции поли(С)-связывающих белков 11
1.6.1. Регуляция транскрипции 11
1.6.2. Регуляция трансляции 12
1.6.3. Участие в сплайсинге 13
1.6.4. Участие в метаболизме железа 13
1.6.5. Регуляции плюрипотентности 14
1.6.6. Роль в развитии рака 15
Глава 2. Материалы и методы 17
2.1 Получение СК18РК/Са89-плазмиды для нокаута PCBP2 в ЭС клетках мыши 17
2.1.1 Сборка плазмиды с помощью лигирования 17
2.1.2 Трансформация хемикомпетентных бактерий 17
2.1.3. Выделение плазмидной ДНК из E. coli 18
2.1.4 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 19
2.2. Исследование продукции изучаемых белков в ЭС клетках мыши 19
2.2.1. Культивирование эмбриональных стволовых клеток мыши 19
2.2.2. Трансфекция эмбриональных стволовых клеток мыши 20
2.2.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток 20
2.2.4. Измерение интенсивности флуоресценции клеток 21
2.2.5. Статистические методы 21
Глава 3. Результаты и обсуждение 22
3.1 Получение СК18РК/Са89-плазмиды для нокаута PCBP2 в ЭС клетках мыши 22
3.2. Трансфекция оверэкспрессирующими и нокаутными плазмидами ЭС клеток и их окраска на исследуемые белки с помощью методов иммуноцитохимии 24
3.2.1. Сверхпродукция поли(С)-связывающих белков и продукция Oct-4 25
3.2.2. Нокаут генов, кодирующих поли(С)-связывающие белки и продукция Oct-4 25
3.3. Сравнение уровней продукции поли(С)-связывающих белков c уровнем продукции Oct-4 28
3.3.1 Влияние сверхпродукции hnRNP K, PCBP1, PCBP2 на уровень продукции Oct-4 28
3.3.2 Влияние нокаута PCBP1, PCBP2 на продукцию Oct-4 28
Выводы 34
Список литературы 35
В последние десятилетия благодаря развитию молекулярной и клеточной биологии возросли потенциальные возможности для биологии и медицины. Стволовые клетки имеют ряд уникальных особенностей: неограниченное деление в культуре и способность к дифференцировке в различные типы тканей и органов. Занимаясь биологическими исследованиями, возможно эффективно проводить изучение генных нокаутов - так, после разработки методов получения эмбриональных стволовых клеток стало возможным проведение нокаута генов на мыши (Evans et al., 1981). Также одним из перспективных направлений в медицине является заместительная клеточная/тканевая терапия стволовыми клетками. Однако существует немало препятствий в этой области, например, туморогенный эффект, вызываемый неконтролируемым делением плюрипотентных клеток. Попадание в организм мыши всего нескольких клеток вызывает развитие опухоли.
Таким образом, прежде чем эффективно интегрировать в терапию данную технологию, необходимо досконально изучить фундаментальные вопросы связанные с молекулярными механизмами регуляции стволовых клеток.
Поли(С)-связывающие белки, присутствуют во всех эукариотических и прокариотических организмах. Поли(С)-связывающие белки отвечают за огромное количество функций в клетке, например, сплайсинг, транскрипция, трансляция и т.д. К настоящему времени существует большое количество исследований посвященных влиянию этих белков на развитие и супрессию рака и участию в транспорте важнейшего металла - железа. В наши дни, одной из дискуссионных функций этих белков является их влияние на плюрипотентные свойства клеток (например, Thompson et al. 2015). Согласно данным нашей лаборатории, поли(С)-связывающие белки hnRNPK и PCBP1-PCBP3 связываются с сайтом 2A дистального энхансера гена Oct-4. Ген Oct-4 один из ключевых участников поддержания плюрипотентного состояния клеток . Возникла необходимость изучить возможную корреляцию между различными уровнями продукции поли(С)-связывающих белков и экспрессией Oct-4.
Целью данной работы является: получение предварительных данных о влиянии сверхпродукции и понижения уровня продукции поли(С)-связывающих белков на уровень продукции белка Oct-4 в эмбриональных стволовых клетках мыши.
В соответствии с поставленной целью, необходимо решить ряд задач:
1. Получить СК18РК/Са89-плазмиду для нокаута PCBP2.
2. Трансфецировать оверэкспрессирующими и нокаутными плазмидами ЭС клетки мыши и оценить изменение уровня продукции поли(С)-связывающих белков и Oct-4.
3. Оценить возможное влияние уровня продукции белков hnRNP K, PCBP1, PCBP2 на уровень синтеза белка Oct-4.
ВЫВОДЫ:
1. Полученная CRISPR/Cas9-nna3MHga снижает уровень продукции PCBP2.
2. После трансфекции оверэкспресирующими плазмидами (LVTHM-T7- hnRNPK, LVTHM-T7-PCBP1, LVTHM-T7-PCBP2) значительных изменений уровня продукции Oct-4 не установлено.
3. При нокауте PCBP2 с использованием CRISPR/Cas9-nлaзмиды pX330- KO-PCBP2 не изменялся уровень продукции белка Oct-4.
4. После нокаута PCBP1 с использованием CRISPR/Cas9-nлaзмиды pX330- KO-PCBP1 понижался уровень продукции белка Oct-4.
