Введение 4
Глава 1. Обзор литературы 5
1.1 Плазмиды как векторы для доставки ДНК в клетки реципиентов 5
1.2 Альтернатива E.coli как системы синтеза гетерологичных белков 6
1.3 Определение пробиотиков 9
1.4 Характеристика бактерий рода Enterococcus и их применение в качестве
пробиотических препаратов 10
1.5 Характеристика бактериоцинов энтерококков 12
1.6 Области применения флуоресцентных белков 14
Глава 2. Материалы и методы 17
2.1 Штаммы и условия культивирования 17
2.2 Выделение и очистка ДНК 17
2.2.1 Экспресс выделение геномной ДНК методом термического лизиса 17
2.2.2 Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli 17
2.2.3 Экстракция тотальной ДНК 18
2.2.4 Выделение ДНК из агарозного геля 19
2.2.5 Очистка ПЦР амплификата 19
2.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 19
2.4 Линейный электрофорез в агарозном геле 20
2.5 Молекулярное клонирование 20
2.5.1 Рестрикция вектора и амплификата 20
2.5.2 Лигирование 21
2.5.3 Трансформация клеток E.coli 21
2.6 Электропорация клеток E.faecium 21
2.7 Оценка экспрессии репортерных генов 22
2.7.1 Детекция флуоресценции 22
2.7.2 Индукция флуоресценции синтетическим феромоном EntF 22
2.7.3 Оценка стабильности плазмид в энтерококках 23
Глава 3. Результаты 24
3.1 ПИР-амплификация слитых конструкций, состоящих из промоторной области
гена entA и кодирующей части репортерного гена 24
3.2 Клонирование слитых конструкций в плазмиду и трансформация E.coli 26
3.3 Электропорация E.faecium 28
3.4 Индукция экспрессии репортерных генов при помощи синтетического
феромона 32
3.5 Оценка стабильности плазмиды pBSU101 в клетках энтерококков 33
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 35
Заключение 38
Выводы 40
Список литературы 41
В настоящее время идет активный поиск новых систем экспрессии рекомбинантных генов в клетках самых разных микроорганизмов. Одним из перспективных направлений этого поиска можно считать создание рекомбинантных штаммов энтерококков, которые могут быть применены в качестве «живых вакцин» - пробиотических штаммов содержащих рекомбинантные плазмиды и экспрессирующих поверхностные антигенные белки патогенных бактерий (Гупаловаи др.,2013).
Одними из наиболее удобных для использования репортерных генов на ранних этапах разработки экспрессионных векторов являются гены, кодирующие разнообразные флуоресцентные белки. Наблюдать экспрессию этих генов в бактериальных культурах возможно без трудоемкого этапа выделения и анализа мРНК.
Кроме того, в настоящее время активно изучается возможность использования энтерококков в качестве пробиотических бактерий для человека и животных. Создание штамма энтерококков, прижизненно меченного флуоресцентными белками, могло бы способствовать изучению длительности персистирования, локализации и установлению эффективности вводимых пробиотиков в организме лабораторных животных.
В связи с этим была поставлена следующая цель исследования:
Исследовать экспрессию рекомбинантных генов, помещенных под контроль промотора гена entA в клетках энтерококков.
Задачи исследования:
1. Создать генетическую конструкцию, состоящую из кодирующей части генов флуоресцентных белков turborfp и egfp, и промоторной области гена entA штамма Enterococcus faeciumL-3.
2. Создать плазмидный вектор, содержащий полученную генетическую конструкцию и внедрить его в клетки в клетки Enterococcus faecium.
3. Качественно оценить экспрессию репортерных генов в клетках полученных рекомбинантных штаммов.
В результате проведенной работы был получен рекомбинантный вектор, созданный на основе плазмиды широкого круга хозяев pAT29, в которую была встроена слитая конструкция из кодирующей области гена turborfp и промоторной области гена entA. Внедрение данного вектора в клетки штамма E.coli JM109 привело к появлению целевого фенотипа у бактериальных клеток. При этом присутствие данного вектора в клетках E.faecium A64 привело к приобретению ими устойчивости к селективному фактору спектиномицину, но способность к флуоресценции у штаммов отсутствовала. При трансформации того же штамма E.faecium плазмидой pBSU101, содержащей ген egfp, наблюдали появление характерной флуоресценции у энтерококков. Это привело нас к заключению, что для применения в качестве репортерного гена, позволяющего оценить экспрессию гетерологичных генов в энтерококках, а также для их прижизненного мечения, следует использовать ген egfp вместо turborfp.
В перспективе планируется использовать полученные данные для конструирования рекомбинантных векторов, которые могли бы способствовать гетерологичной экспрессии генов в клетках различных грамположительных и грамотрицательных бактерий.
