Совершенствование штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемых в альфа-тесте для выявления генотоксических факторов
|
ВВЕДЕНИЕ 3
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1. Генетические основы альфа-теста 6
1.1 Жизненный цикл дрожжей Saccharomyces cerevisiae и генетический контроль типа
спаривания 6
1.2 Альфа-тест и генетические события, учитываемые с его использованием 10
1.3 Штаммы дрожжей, используемые в альфа-тесте, и возможные направления их
совершенствования 14
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 19
1. Штаммы дрожжей S. cerevisiae 19
2. Плазмиды 20
3. Среды и условия культивирования 21
4. Трансформация 22
4.1 Трансформация дрожжей S. cerevisiae 22
4.2 Трансформация бактерий E. coli 22
5. Молекулярно-генетические методы 23
6. Методы частной генетики дрожжей 24
7. Альфа-тест 24
8. Качественное определение частоты возникновения «незаконных» гибридов 25
9. Статистические методы 25
РЕЗУЛЬТАТЫ 26
1. Модификация тестерного штамма, используемого в альфа-тесте, путём внесения
мутации mata2 и проверка эффективности этой модификации в тесте на «незаконную» гибридизацию 26
2. Генетическая модификация дрожжевого штамма, используемого в альфа-тесте в
качестве партнёра для скрещивания и проверка его эффективности 28
2.1 Получение штамма G-10B-OM5, несущего промоторpGALl в центромере хромосомы
III и проверка эффективности этой модификации 29
2.2 Конструирование штамма GM-10B-OM5, несущего дополнительную копию локуса
MATa в левом плече и промоторpGALl в центромере хромосомы III и проверка эффективности его использования в альфа-тесте 30
ОБСУЖДЕНИЕ 36
ВЫВОДЫ 40
БЛАГОДАРНОСТИ 41
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 42
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1. Генетические основы альфа-теста 6
1.1 Жизненный цикл дрожжей Saccharomyces cerevisiae и генетический контроль типа
спаривания 6
1.2 Альфа-тест и генетические события, учитываемые с его использованием 10
1.3 Штаммы дрожжей, используемые в альфа-тесте, и возможные направления их
совершенствования 14
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 19
1. Штаммы дрожжей S. cerevisiae 19
2. Плазмиды 20
3. Среды и условия культивирования 21
4. Трансформация 22
4.1 Трансформация дрожжей S. cerevisiae 22
4.2 Трансформация бактерий E. coli 22
5. Молекулярно-генетические методы 23
6. Методы частной генетики дрожжей 24
7. Альфа-тест 24
8. Качественное определение частоты возникновения «незаконных» гибридов 25
9. Статистические методы 25
РЕЗУЛЬТАТЫ 26
1. Модификация тестерного штамма, используемого в альфа-тесте, путём внесения
мутации mata2 и проверка эффективности этой модификации в тесте на «незаконную» гибридизацию 26
2. Генетическая модификация дрожжевого штамма, используемого в альфа-тесте в
качестве партнёра для скрещивания и проверка его эффективности 28
2.1 Получение штамма G-10B-OM5, несущего промоторpGALl в центромере хромосомы
III и проверка эффективности этой модификации 29
2.2 Конструирование штамма GM-10B-OM5, несущего дополнительную копию локуса
MATa в левом плече и промоторpGALl в центромере хромосомы III и проверка эффективности его использования в альфа-тесте 30
ОБСУЖДЕНИЕ 36
ВЫВОДЫ 40
БЛАГОДАРНОСТИ 41
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 42
Впервые химический мутагенез был описан в 40-е годы прошлого столетия в работах И. А. Рапопорта и Ш. Ауэрбах, независимо обнаруживших влияние некоторых веществ на частоту мутаций у дрозофилы. С тех пор был выявлен широкий спектр химических и физических агентов, способных повреждать генетический материал живых организмов. Агенты, потенциально способные влиять на стабильность генома, могут входить в состав фармацевтических препаратов, бытовой химии, косметических продуктов, пестицидов и инсектицидов, отходов промышленного производства, токсинов бактерий и грибов. К примеру, бутилпарабен и бисфенол А, обнаруженные в косметических продуктах, фармацевтике и пищевых продуктах, исследователи связывают с повреждениями ДНК в сперматозоидах (Oishi, 2002; Meeker et al., 2010). Мутагенным действием обладают также физические воздействия, например, ультрафиолетовое и ионизирующее излучения. Мутагенные факторы индуцируют повреждения ДНК, которые являются субстратом систем репарации. Абсолютное большинство повреждений ДНК эффективно устраняется системами репарации с полным восстановлением структуры и последовательности ДНК. Однако в результате ошибок систем репарации небольшая часть первичных повреждений может превращаться в наследуемые генные мутации или хромосомные перестройки, что приводит к негативным последствиям, таким как наследственные и онкологические заболевания, а также снижение жизнеспособности и ускорение процессов старения (Nasheuer, 2010). Несмотря на высокую эффективность репарации, достаточно большое количество повреждений ДНК может сохраняться до момента или возникать во время репликации ДНК, особенно на фоне воздействия сильных мутагенов, вызывающих серьезные нарушения структуры ДНК, такие как крупные аддукты и разрывы молекулы ДНК. При репликации поврежденной ДНК также с высокой частотой возникают генные, хромосомные и геномные мутации.
К 1960-м годам были накоплены обширные данные о потенциальной опасности некоторых мутагенов для человека. В связи с этим возникло новое направление исследований на стыке генетики, токсикологии и биохимии - генетическая токсикология, основной целью которого стала оценка способности химических веществ и физических факторов индуцировать мутации в клетках человека. В генетической токсикологии существуют две проблемы: во-первых, нет способа, позволяющего напрямую оценить мутагенную и канцерогенную опасность генотоксических факторов для человека, без вреда для самого человека, во-вторых, при массовых скринингах необходимо тестировать большой объем потенциально опасных мутагенов, что существенно повышает стоимость тестирования на модели млекопитающих. Поэтому для проведения массовых тестов используют тест-системы, позволяющие выявлять определенные нарушения генетического материала на простых моделях. Создание универсальной тест-системы все еще не представляется возможным, поэтому были разработаны батареи тестов, состоящие из нескольких ГОСТированных тест-систем, которые дополняют друг друга и в разной степени решают указанные проблемы генетической токсикологии. Проверку различных веществ на наличие мутагенной активности проводят в несколько этапов (de Serres et al., 1980). На первом этапе с целью выявления потенциальных мутагенов, чаще всего используют тест Эймса, позволяющий выявлять реверсии у бактерий Salmonella typhimurium. Реже используют тесты на учет рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций или соматического мозаицизма у плодовой мушки Drosophila melanogaster, микроядерный тест полихроматофильных эритроцитов костного мозга грызунов. Тесты, используемые на начальном этапе, являются краткосрочными и наименее трудоемкими, что позволяет проводить быстрый скрининг большого количества факторов на наличие у них мутагенных свойств. Однако надежность результатов зависит от филогенетической близости тестера к человеку, поэтому вещества, показавшие мутагенную активность на первом этапе, рекомендуют ко второму и, при необходимости, третьему этапам тестирования. На заключительных этапах тестирования в основном используют методы учета мутаций в соматических и половых клетках млекопитающих и человека, таких как учет доминантных леталей в зародышевых клетках мышей, метод специфических локусов и транслокационный тест у мышей (Абилев и Глазер, 2015). После второго этапа мутагены либо однозначно запрещаются к использованию, либо, при незаменимости или особой значимости, проходят проверку на способность индуцировать мутации в половых клетках млекопитающих. Тесты на данных этапах являются дорогостоящими и длительными: метод изучения канцерогенной активности одного вещества на грызунах требует около двух лет работы и около 800 мышей и крыс на исследование одного вещества (Абилев и Глазер, 2015).
Уникальное положение среди известных тест-систем занимает пока не ГОСТированный альфа-тест, разработанный сотрудниками кафедры генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета. Его отличительной особенностью является способность выявлять фенотипическое проявление первичных повреждений до их исправления системами репарации ДНК и фиксации в форме генных или хромосомных мутаций, а также способность различать первичные повреждения и наследуемые изменения генетического материала (Репневская и др., 1989). Благодаря этим особенностям и широкому спектру регистрируемых нарушений использование альфа-теста
может быть весьма перспективно для первичного скрининга мутагенных факторов. Также возможность выявлять разные по своей природе изменения ДНК может быть использована для изучения синергизма мутагенных эффектов.
К настоящему моменту проведён целый ряд научно-исследовательских работ, подтверждающих эффективность использования альфа-теста, а также опубликованы результаты исследований, в которых альфа-тест был использован в качестве главного метода для изучения процессов мутагенеза. (Inge-Vechtomov, 1985; Инге-Вечтомов и др., 1989; Репневская, 1989; Lemoine et al., 2005; Коченова и др., 2008; Kochenova et al, 2011; Андрейчук, 2012; Жук, 2016; Novoa et al., 2018). В ходе этих исследований были получены результаты, позволившие наметить направления для дальнейшего совершенствования и упрощения альфа-теста, что, безусловно, важно для ускорения внедрения метода в практику и повышения эффективности альфа-теста. На основе анализа имеющихся экспериментальных данных мы сформулировали ряд предложений по модификации штаммов дрожжей, которые, как мы ожидаем, приведут к усовершенствованию альфа- теста. Таким образом, целью данной работы является совершенствование альфа-теста, направленное на упрощение процедуры тестирования и повышение чувствительности тест- системы. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
1. Модифицировать тестерный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae путём внесения мутации mata2.
2. Модифицировать штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемый в альфа-тесте для регистрации переключения типа спаривания у тестерного штамма, путем внесения следующих модификаций III хромосомы: инсерция промотера pGALl в центромеру и инсерция дополнительной копии локусаMATa в левое плечо хромосомы III.
3. Разработать методику проведения альфа-теста с использованием полученных штаммов.
4. Оценить эффективность полученных штаммов для создания обновленной тест-системы.
К 1960-м годам были накоплены обширные данные о потенциальной опасности некоторых мутагенов для человека. В связи с этим возникло новое направление исследований на стыке генетики, токсикологии и биохимии - генетическая токсикология, основной целью которого стала оценка способности химических веществ и физических факторов индуцировать мутации в клетках человека. В генетической токсикологии существуют две проблемы: во-первых, нет способа, позволяющего напрямую оценить мутагенную и канцерогенную опасность генотоксических факторов для человека, без вреда для самого человека, во-вторых, при массовых скринингах необходимо тестировать большой объем потенциально опасных мутагенов, что существенно повышает стоимость тестирования на модели млекопитающих. Поэтому для проведения массовых тестов используют тест-системы, позволяющие выявлять определенные нарушения генетического материала на простых моделях. Создание универсальной тест-системы все еще не представляется возможным, поэтому были разработаны батареи тестов, состоящие из нескольких ГОСТированных тест-систем, которые дополняют друг друга и в разной степени решают указанные проблемы генетической токсикологии. Проверку различных веществ на наличие мутагенной активности проводят в несколько этапов (de Serres et al., 1980). На первом этапе с целью выявления потенциальных мутагенов, чаще всего используют тест Эймса, позволяющий выявлять реверсии у бактерий Salmonella typhimurium. Реже используют тесты на учет рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций или соматического мозаицизма у плодовой мушки Drosophila melanogaster, микроядерный тест полихроматофильных эритроцитов костного мозга грызунов. Тесты, используемые на начальном этапе, являются краткосрочными и наименее трудоемкими, что позволяет проводить быстрый скрининг большого количества факторов на наличие у них мутагенных свойств. Однако надежность результатов зависит от филогенетической близости тестера к человеку, поэтому вещества, показавшие мутагенную активность на первом этапе, рекомендуют ко второму и, при необходимости, третьему этапам тестирования. На заключительных этапах тестирования в основном используют методы учета мутаций в соматических и половых клетках млекопитающих и человека, таких как учет доминантных леталей в зародышевых клетках мышей, метод специфических локусов и транслокационный тест у мышей (Абилев и Глазер, 2015). После второго этапа мутагены либо однозначно запрещаются к использованию, либо, при незаменимости или особой значимости, проходят проверку на способность индуцировать мутации в половых клетках млекопитающих. Тесты на данных этапах являются дорогостоящими и длительными: метод изучения канцерогенной активности одного вещества на грызунах требует около двух лет работы и около 800 мышей и крыс на исследование одного вещества (Абилев и Глазер, 2015).
Уникальное положение среди известных тест-систем занимает пока не ГОСТированный альфа-тест, разработанный сотрудниками кафедры генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета. Его отличительной особенностью является способность выявлять фенотипическое проявление первичных повреждений до их исправления системами репарации ДНК и фиксации в форме генных или хромосомных мутаций, а также способность различать первичные повреждения и наследуемые изменения генетического материала (Репневская и др., 1989). Благодаря этим особенностям и широкому спектру регистрируемых нарушений использование альфа-теста
может быть весьма перспективно для первичного скрининга мутагенных факторов. Также возможность выявлять разные по своей природе изменения ДНК может быть использована для изучения синергизма мутагенных эффектов.
К настоящему моменту проведён целый ряд научно-исследовательских работ, подтверждающих эффективность использования альфа-теста, а также опубликованы результаты исследований, в которых альфа-тест был использован в качестве главного метода для изучения процессов мутагенеза. (Inge-Vechtomov, 1985; Инге-Вечтомов и др., 1989; Репневская, 1989; Lemoine et al., 2005; Коченова и др., 2008; Kochenova et al, 2011; Андрейчук, 2012; Жук, 2016; Novoa et al., 2018). В ходе этих исследований были получены результаты, позволившие наметить направления для дальнейшего совершенствования и упрощения альфа-теста, что, безусловно, важно для ускорения внедрения метода в практику и повышения эффективности альфа-теста. На основе анализа имеющихся экспериментальных данных мы сформулировали ряд предложений по модификации штаммов дрожжей, которые, как мы ожидаем, приведут к усовершенствованию альфа- теста. Таким образом, целью данной работы является совершенствование альфа-теста, направленное на упрощение процедуры тестирования и повышение чувствительности тест- системы. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
1. Модифицировать тестерный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae путём внесения мутации mata2.
2. Модифицировать штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемый в альфа-тесте для регистрации переключения типа спаривания у тестерного штамма, путем внесения следующих модификаций III хромосомы: инсерция промотера pGALl в центромеру и инсерция дополнительной копии локусаMATa в левое плечо хромосомы III.
3. Разработать методику проведения альфа-теста с использованием полученных штаммов.
4. Оценить эффективность полученных штаммов для создания обновленной тест-системы.
1. Использование штамма mata2 в качестве тестерного приводит к возрастанию общей частоты «незаконной» гибридизации и частоты отдельных классов «незаконных» гибридов по сравнению со штаммом MATa2, что приблизительно на порядок повышает чувствительность альфа-теста в отношении спонтанных и УФ-индуцированных нарушений генетического материала.
2. В наибольшей степени использование мутации mata2 способствует повышению чувствительности альфа-теста в отношении класса «мутации и временные повреждения», но не в отношении хромосомных нарушений.
3. Установлено, что генетическая модификация штамма-партнера для скрещивания, заключающаяся в инсерции pGALl в центромеру хромосомы III, эффективна для усовершенствования альфа-теста путем объединения тестов на «незаконную» гибридизацию и «незаконную» цитодукцию в рамках одной процедуры.
4. Дополнительная копия локуса MATa, внесенная в левое плечо хромосомы III, лишь незначительно снижает частоту образования «незаконных» гибридов, и поэтому такая модификация не эффективна для снижения влияния генетических нарушений в геноме штамма-партнера для скрещивания на общие результаты альфа-теста.
2. В наибольшей степени использование мутации mata2 способствует повышению чувствительности альфа-теста в отношении класса «мутации и временные повреждения», но не в отношении хромосомных нарушений.
3. Установлено, что генетическая модификация штамма-партнера для скрещивания, заключающаяся в инсерции pGALl в центромеру хромосомы III, эффективна для усовершенствования альфа-теста путем объединения тестов на «незаконную» гибридизацию и «незаконную» цитодукцию в рамках одной процедуры.
4. Дополнительная копия локуса MATa, внесенная в левое плечо хромосомы III, лишь незначительно снижает частоту образования «незаконных» гибридов, и поэтому такая модификация не эффективна для снижения влияния генетических нарушений в геноме штамма-партнера для скрещивания на общие результаты альфа-теста.
Содержание бакалаврской работы – Совершенствование штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемых в альфа-тесте для выявления генотоксических факторов
Выдержки из бакалаврской работы – Совершенствование штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемых в альфа-тесте для выявления генотоксических факторов
Подобные работы
- Совершенствование штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемых в альфа-тесте для выявления генотоксических факторов
Бакалаврская работа, биология. Язык работы: Русский. Цена: 4300 р. Год сдачи: 2019