Введение 3
Глава 1. Обзор литературы 5
1.1 Гаметофитный апомиксис и его роль для интенсификации сельского хозяйства 5
1.2 Таксономия и среда обитания наиболее важных представителей рода Boechera 7
1.3 Преимущества рода Boechera для изучения апомиксиса 10
1.4 Цитоэмбриологические исследования в роде Boechera 11
1.5 Популяционно-генетические исследования апомиксиса в роде Boechera 16
1.6 Наследование и генетические аспекты апомиксиса в роду Boechera 19
1.7 Геномные ресурсы для рода Boecheraи проблемы геномного анализа 25
Глава 2. Материалы и методы исследования 29
2.1 Материал 29
2.2 Методы работы с данными 29
2.2.1 Предобработка данных 29
2.2.2 Примененные стратегии сборки генома 30
2.2.3 Удаление контаминаций из данных Illumina 32
2.2.4 Подготовка к сборке хлоропластной ДНК 33
2.2.5 Сборка и аннотация хлоропластной ДНК 33
2.2.6 Методы филогенетического анализа с использованием хлоропластной ДНК 34
2.2.7 Методы филогенетического анализа с использованием последовательности гена
APOLLO 35
Глава 3. Результаты и обсуждение 37
3.1 Анализ и коррекция исходных прочтений 37
3.2 Выбор наилучшей стратегии сборки высоко гетерозиготного генома Boechera
divaricarpa M4B 40
3.2.1 De novo сборка генома Boechera divaricarpa M4Bпрограммой MaSuRCA 40
3.2.2 De novo сборка генома Boechera divaricarpa M4Bпрограммой Platanus 41
3.2.3 Сравнительная характеристика различных стратегий сборки высоко
гетерозиготного генома Boechera divaricarpa M4B 41
3.2.4 Очистка исходных коротких прочтений генома Boechera divaricarpa M4B
выравниванием на наиболее успешную сборку 42
3.3 Анализ хлоропластной ДНК Boechera divaricarpaлиний M4Bи ES517 46
3.3.1 Подготовка прочтений для сборки хлоропластной ДНК 46
3.3.2 Реконструкция хлоропластной ДНК и поиск молекулярных маркеров для
филогенетического анализа 48
3.3.3 Определение донора хлоропластов для растений Boechera divaricarpaлиний M4Bи
ES517 48
3.4 Анализ ядерной ДНК Boechera divaricarpaлиний ES517и M4B 51
Заключение 54
Выводы 55
Список литературы 56
Половое размножение является одним из важнейших инструментов формирования генетического разнообразия организмов. В дикой природе оно обуславливает постоянную смену генотипов популяций, тем самым обеспечивая материал для адаптивной эволюции. Образование различных комбинаций генов в ходе данного процесса способно привести к появлению более приспособленного к условиям среды фенотипа. Тем не менее, этот же способ размножения может привести к расщеплению полезных признаков в потомстве, ввиду чего последующие поколения не будут обладать особыми свойствами родителей. Данная проблема особенно актуальна в областях, связанных с селекцией растений и животных, например, в сельском хозяйстве. Специально выведенные сорта растений рано или поздно теряют характерные для них качества из-за размножения половым путем, что не позволяет культивировать их в долгосрочной перспективе. Бесполое размножение также встречается у представителей высших растений, но наиболее частой формой такового является вегетативное размножение, не способное стать решением поставленной проблемы, ввиду сложности его реализации в промышленных масштабах.
Альтернативой бесполому размножению через ткани организма для агропромышленности может стать апомиксис — партеногенез, наблюдаемый у ряда растений в дикой природе. При апомиксисе потомство остается генетически идентичным родителю, и при этом размножение происходит через формирование семян, а значит его внедрение в сельское хозяйство не потребует разработки специальных методик выращивания. К сожалению, на данный момент искусственная интеграция данного типа размножения в выращиваемые сорта невозможна, поскольку до конца не установлены молекулярные механизмы его регуляции. Не так давно исследователи обратили внимание на растения рода Boechera,как на потенциальные модельные объекты для изучения генетических аспектов апомиксиса. Виды, принадлежащие роду Boechera,обладают рядом особенностей, значительно облегчающих изучение такого типа бесполого размножения. Особенный интерес представляют диплоидные гибриды данного рода, которые характеризуются высокой пенетрантностью апомиксиса, обладая при этом геномом, близкородственным генетическому материалу половых линий.
Цель работы: Сборка генома Boechera divaricarpaлинии M4Bи ее сравнительный анализ с геномом линии ES517.
Задачи:
• Реализация и сравнение различных стратегий de novoсборки ядерной ДНК с целью выявления наиболее эффективного подхода к работе с высоко гетерозиготными организмами.
• Сборка и аннотация хлоропластной ДНК Boechera divaricarpa M4Bс ее последующим филогенетическим анализом.
• Поиск гена APOLLO в полученной сборке и последовательностях других представителей рода Boecheraи дальнейший филогенетический анализ по этому маркеру.
В работе были реализованы различные стратегии сборки высоко гетерозиготных геномов, с дальнейшей статистической обработкой их результатов. Полученные сборки сравнивались между собой и со сборками, предоставленными сотрудниками Центра геномной биоинформатики им. Ф. Г. Добржанского, в ходе чего была определена наиболее эффективная методика для работы с сырыми прочтениями геномов высоко гетерозиготных организмов - гибридная сборка из длинных и коротких прочтений программой MaSuRCA.
С использованием отработанного метода гибридной сборки ДНК, был реконструирован генетический материал хлоропластов Boechera divaricarpa M4Bи проведен его филогенетический анализ с использованием Байесовской статистики. В ходе анализа были получены уникальные данные о наследовании хлоропластной ДНК линии M4Bот вида Boechera stricta,а также продемонстрировано, что линия ES517унаследовала генетический материал пластид не от представителей этого вида. Чтобы уточнить филогению хлоропластной ДНК линии ES517требуется рассмотреть большее количество изолятов различных видов, и, в частности, изолятов вида B. retrofracta.
В собранном геноме линии M4Bбыла найдена последовательность гена APOLLO, после чего был проведен филогенетический анализ, включающий последовательности обеих рассматриваемых линий B. divaricarpa. В ходе анализа были сделаны выводы о вероятной гомозиготности линии ES517по апомиктичному аллелю гена, и гетерозиготности линии M4B, тем не менее, для точного определения состава аллелей необходим анализ копийности гена APOLLO в геномах рассмотренных линий.
