Введение 4
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1 Ветвление корня, основные этапы образования бокового корня 6
1.2 Роль ауксина в инициации и развитии примордия бокового корня 9
1.3 Механизмы транспорта ауксина. Классификация транспортеров ауксина 10
1.4 Общая характеристика семейства белков PIN 14
1.5 Формирование боковых корней в меристеме родительского корня 22
Глава 2. Материалы и методы 24
2.1 Материалы 24
Растительный материал и условия выращивания растений 24
Штаммы микроорганизмов 24
Условия культивирования микроорганизмов 24
2.2 Молекулярно-генетические методы исследования 25
Филогения и биоинформатика 25
Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli 26
Выделение плазмидной ДНК из Agrobacterium rhizogenes 26
Выделение общей ДНК из растительных тканей 27
Выделение общей РНК из растительных тканей 27
Полимеразная цепная реакция 27
ПЦР-скрининг бактериальных колоний 30
ПЦР с перекрывающимися праймерами 30
ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 30
Разделение фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле 31
Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 31
Трансформация компетентных клеток Escherichia coli 32
Трансформация компетентных клеток Agrobacterium rhizogenes 32
2.3 Создание генетических конструкций 32
2.4 Трансформация растений штаммами Agrobacterium rhizogenes 33
Получение асептического материала 33
Агробактериальная трансформация растений 34
Отбор трансгенных корней для локализации PIN1 в кончике корня кабачка .35
2.5 Методы микроскопии 35
Пробоподготовка материала для локализации кодирующей последовательности PIN1, слитой с флуоресцентным белком mNeonGreen 35
Пробоподготовка материала для иммунолокализации белка PIN1 36
Г лава 3. Результаты и обсуждение 39
3.1 Поиск и идентификация нуклеиновой последовательности ортолога гена PIN 1
Arabidopsis thaliana у Cucurbita pepo 39
3.2 Создание генетических конструкций для анализа локализации белка PIN1.. . 41
Подбор праймеров для клонирования промоторной и кодирующей последовательности PIN1 кабачка 41
ПЦР с праймерами к промоторной последовательности PIN1 кабачка 41
Проверка ориентации вставки последовательности промотора CpPIN1. в вектор 369_pENTRattL4attR1_B SAI 42
ПЦР с кДНК и праймерами к кодирующей последовательности PIN1 кабачка 42
ПЦР с перекрывающимися праймерами, плазмидной ДНК и праймерами к кодирующей последовательности и флуоресцентному белку Neon.Green . .43
Проверка наличия.вставки кодирующей последовательности. .44
Сборка конечного вектора. .45
3.3 Локализация белка PIN1 в кончике корня кабачка в связи с анализом его роли в регуляции инициации и развития примордиев. .46
Заключение 50
Выводы 51
Список.литературы. .52
Изучение корней и корневых систем необходимо для понимания правильного развития растений. Актуальность проблемы определяется, во-первых, тем, что корневая система составляет значительную часть растительного организма и позволяет растению закрепляться в почве. Во-вторых, корневая система играет главную роль в водном и минеральном питании растения, и, наконец, активно участвует в симбиозе с множеством почвенных микроорганизмов.
Способность корней к ветвлению является одной из наиболее важных функций системы, так как растения, в отличие от животных организмов, не могут активно перемещаться. Необходимость компенсации неравномерного распределения питательных веществ в среде приводит к регулярному образованию боковых корней, что позволяет растению постоянно получать новые элементы для питания .
Интерес научного сообщества к данной теме возрастает с каждым годом, о чём свидетельствует все большее количество работ, посвященных изучению регуляции формирования боковых корней. На данный момент достоверно показано, что фитогормон ауксин играет ключевую роль в процессе инициации примордия бокового корня (Dubrovsky et al. 2008; Overvoorde et al. 2010; Du, Scheres. 2017; Ilina et al. 2018). Формирование направленного тока ауксина обеспечивается семейством белков PIN- FORMED - его главными транспортерами (Kramer, Bennett. 2006; Grunewald, Friml. 2010). Из-за различной локализации этих белков на мембране отток ауксина из клеток растения возможен в разных направлениях.
Результаты данной работы обладают также практической значимостью, поскольку позволят внести вклад в теоретическую базу, которая является основой стабильного инновационного сельского хозяйства в Российской Федерации. Выявлены структурные и молекулярно-генетические механизмы инициации бокового корня, которые являются теоретическими основами для создания высокоэффективных и устойчивых сортов культурных растений.
Целью работы является анализ локализации и роли PIN1 белка в формировании максимума клеточного ответа на ауксин при инициации бокового корня в меристеме родительского корня кабачка (Cucurbitapepo L., сем. Cucurbitaceae).
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:
1. Поиск и идентификация белков семейства PIN у кабачка;
2. Создание репортерной конструкции и анализ локализации CpPIN1 белка в трансгенных корнях кабачка;
3. Иммунолокализация PIN 1 белка в кончике корня кабачка;
4. Анализ роли PIN1 на ранних этапах инициации бокового корня у кабачка.
В работе был проведен поиск ортолога белка PIN4 огурца у кабачка (Cucurbita pepo) с использованием баз данных Phytozome, Cucurbit Genomics Database и алгоритма BLAST (cucurbitgenomics.org). Сравнение белковых и нуклеотидных последовательностей показало высокий процент гомологии белков PIN4 у огурца и у кабачка.
Были подобраны праймеры для клонирования промоторной и кодирующей последовательностей гена CpPINl. Для локализации CpPINl в кончике корня кабачка была создана генетическая конструкция pKGW-RR-MGW-pCpPIN1::PIN1-NeonGreen- TermAct и проведена иммунолокализация белка, с помощью антител против AtPIN1, на трансгенных корнях кабачка, несущих репортерную конструкцию для визуализации максимумов клеточного ответа на ауксин (DR5::GFP-NLS). Анализ продольных срезов кончиков корней кабачка, содержащих вставку pCpPIN1::PIN1-NeonGreen-TermAct, показал, что паттерн распределения белка CpPIN1 на мембране клеток аналогичен паттерну распределения белка PIN1 у Arabidopsis. Иммунолокализация AtPIN1 в корнях кабачка показала, что PIN1, перераспределяясь на мембране, направляет ток ауксина в соседние клетки, создавая в них максимум клеточного ответа на ауксин.
В процессе работы были освоены методы выделения плазмидной и геномной ДНК, выделения общей РНК, методы ПЦР, ПЦР с колоний, ПЦР с перекрывающимися праймерами и ПЦР с обратной транскрипции, технология клонирования Gateway, трансформация клеток Escherichia coli и Agrobacterium rhizogenes, агробактериальная трансформация проростков кабачка, иммунолокализация растений, освоена техника приготовления продольных и поперечных с помощью микротома с вибрирующим лезвием, освоена техника лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
Содержание бакалаврской работы – Роль PIN-белков в формировании максимума клеточного ответа на ауксин при инициации боковых корней у кабачка (Cucurbita pepo L.)
Выдержки из бакалаврской работы – Роль PIN-белков в формировании максимума клеточного ответа на ауксин при инициации боковых корней у кабачка (Cucurbita pepo L.)
