Макропористые проточные биореакторы для деструкции фукоидана
|
ВВЕДЕНИЕ 3
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 6
1.1 Фукозидазы 6
1.1.1 Субстратная специфичность и свойства 6
1.1.2 Использование фукозидаз для гидролиза фукоидана 7
1.2 Сравнение гомогенного и гетерогенного биокатализа 10
1.3 Способы проведения гетерогенного биокатализа 15
1.4 Стационарные фазы для иммобилизации ферментов 19
1.5 Макропористые монолитные материалы 21
1.5.1 Преимущества перед другими материалами для иммобилизации ферментов 21
1.5.2 Способы получения 23
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 27
2.1 Материалы 27
2.2 Оборудование 28
2.3 Получение макропористых монолитных колонок 28
2.3.1 Проведение радикальной полимеризации в блоке 28
2.3.2 Изучение поровых характеристик 30
2.4 Иммобилизация фукозидазы на поверхность полимерного носителя 31
2.4.1 Прямая иммобилизация 31
2.4.2 Иммобилизация через спейсер 31
2.4.3 Определение количества иммобилизованного фермента 33
2.5 Изучение активности фукозидазы 33
2.5.1 Определение активности свободного фермента 34
2.5.2 Определение активности иммобилизованнного фермента 35
2.6 ВЭЖХ анализ фукозы и фукоидана 35
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 36
3.1 Синтез макропористых монолитных колонок и изучение их характеристик 36
3.2 Иммобилизация фермента 41
3.3 Определение активности иммобилизованных ферментов и сравнение с биокатализаторами в растворе 45
3.4 ВЭЖХ анализ фукозы и фукоидана 51
ВЫВОДЫ 53
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 54
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 6
1.1 Фукозидазы 6
1.1.1 Субстратная специфичность и свойства 6
1.1.2 Использование фукозидаз для гидролиза фукоидана 7
1.2 Сравнение гомогенного и гетерогенного биокатализа 10
1.3 Способы проведения гетерогенного биокатализа 15
1.4 Стационарные фазы для иммобилизации ферментов 19
1.5 Макропористые монолитные материалы 21
1.5.1 Преимущества перед другими материалами для иммобилизации ферментов 21
1.5.2 Способы получения 23
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 27
2.1 Материалы 27
2.2 Оборудование 28
2.3 Получение макропористых монолитных колонок 28
2.3.1 Проведение радикальной полимеризации в блоке 28
2.3.2 Изучение поровых характеристик 30
2.4 Иммобилизация фукозидазы на поверхность полимерного носителя 31
2.4.1 Прямая иммобилизация 31
2.4.2 Иммобилизация через спейсер 31
2.4.3 Определение количества иммобилизованного фермента 33
2.5 Изучение активности фукозидазы 33
2.5.1 Определение активности свободного фермента 34
2.5.2 Определение активности иммобилизованнного фермента 35
2.6 ВЭЖХ анализ фукозы и фукоидана 35
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 36
3.1 Синтез макропористых монолитных колонок и изучение их характеристик 36
3.2 Иммобилизация фермента 41
3.3 Определение активности иммобилизованных ферментов и сравнение с биокатализаторами в растворе 45
3.4 ВЭЖХ анализ фукозы и фукоидана 51
ВЫВОДЫ 53
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 54
В настоящее время одним из перспективных направлений исследований в области прикладной биотехнологии является ферментативный катализ, обладающий по сравнению с химическими методами более высокой специфичностью. К тому же биокатализ обычно проводится в достаточно мягких условиях, что позволяет избежать побочных процессов и сохранить субстрат и продукты его деструкции в желаемой форме.
Биокатализаторы находят свое применение в различных областях, включая фармацевтическую и пищевую промышленность. В частности, ведутся работы по получению минорного сахара фукозы и фукоолигосахаридов, играющих важную биологическую роль в метаболизме живых организмов. Одним из способов их получения является биодеструкция природных полимеров под действием ферментов. Так, фукоиданы, доля которых значительна в составе такого доступного и дешевого сырья как бурые водоросли, представляют собой полисахариды с мономерным звеном в виде фукозы и некоторых других сахаров и могут быть подвергнуты биоразложению под действием фермента фукозидазы. Производство в промышленных масштабах данных сахаров не развито. Таким образом, разработка и изучение биореакторов на основе иммобилизованных фукозидаз является крайне актуальной задачей. Разработки в данной области находятся на начальных этапах и требуют проведения исследований активности и оптимизации условий, как применения, так и получения биореакторов. Кроме того, необходимо проведение мониторинга протекающих процессов биодеструкции, а также разделения субстрата и продуктов. Часто и успешно применяемым для решения подобных задач методом является высокоэффективная жидкостная хроматография, позволяющая идентифицировать вещества с их одновременным разделением на фракции.
Однако использование ферментов напрямую, то есть путем добавления в реакционную смесь, сопряжено с рядом проблем. Среди них необходимость тщательно следить за оптимальностью условий проведения реакции ввиду чувствительности к ним фермента - белковая молекула должна сохранять в них свою структуру, не подвергаться денатурации. Помимо этого, возникают дополнительные стадии очисти продуктов от фермента, что усложняет процесс с технологической точки зрения.
Решением возникших проблем стала иммобилизация - связывание фермента за счет ковалентных связей или нековалентных взаимодействий с носителями, чаще всего твердофазными, что позволило значительно повысить стабильность белковой молекулы и расширить границы условий ее применения для катализа. Физические методы иммобилизация (например, адсорбция) просты в исполнении, дают хорошие результаты, хотя не исключают вымывание фермента с поверхности в ходе эксплуатации. Формирование ковалентных связей между ферментом и матрицей позволяет получить более надежные биокатализаторы, дольше сохраняющие свою активность на первоначальном уровне. Кроме того, иммобилизацию можно проводить не напрямую, а через так называемый спейсер - промежуточной соединение, позволяющее отдалить фермент от поверхности. Последний подход сложнее, но позволяет имитировать для фермента состояние близкое к таковому в растворе, сделать активный центр более доступным для субстрата и исключить нековалентные взаимодействия с носителем.
Кроме повышения стабильности, преимуществом иммобилизации является простота отделения биокатализатора от реакционной смеси. Особенно удобны в этом плане биокатилитические системы в виде проточных реакторов, например, хроматографические колонки и диски, заполненные твердой фазой. В первоначальных вариантах носитель чаще всего был представлен в виде гранул - пористых или непористых частиц. В 90-х годах прошлого века был разработан принципиально новый класс твёрдых носителей, а именно макропористые монолитные материалы, представляющие собой единый полимерный блок, пронизанный системой взаимосвязанных капилляров - макропор.
Для заполненных колонок значительную роль играл диффузионный перенос вещества к поверхности носителя и в его поры, что не позволяло использовать высокие скорости потока раствора субстрата через стационарную фазу. В отличие от предшественников, для монолитных материалов преобладает конвективный массоперенос, способствующий снижению сопротивления потоку подвижной фазы и повышению эффективности межфазовых процессов в системе. В связи с этим, разработка методов синтеза макропористых материалов монолитного типа с прогнозируемой поровой структурой и функциональностью представляет собой одно из перспективных направлений в области создания стационарных фаз для реализации гетерогенного биокатализа. Для создания матриц с желаемыми характеристиками, включая размер пор, гидрофильно-гидрофобные свойства поверхности и требуемую функциональность хорошо себя зарекомендовали полиметакрилатные носители.
Исходя из вышеизложенного, целью данной работы являлось получение гетерогенных биокатализаторов на основе макропористых монолитных материалов с иммобилизованной на их поверхности фукозидазой, а также изучение свойств полученных систем
Для достижения данной цели были поставлены следующие задач:
• синтез макропористых полиметакрилатных материалов монолитного типа в форме хроматографических колонок с желаемыми поровыми характеристиками;
• проведение иммобилизации фукозидазы на поверхности макропористых материалов монолитного типа двумя способами: прямым методом и через спейсер;
• исследование каталитической активности иммобилизованных ферментов;
• оптимизация условий разделения субстрата, фукоидана, и продукта его гидролиза, фукозы, методом ВЭЖХ для последующего мониторинга биокаталитического процесса.
Биокатализаторы находят свое применение в различных областях, включая фармацевтическую и пищевую промышленность. В частности, ведутся работы по получению минорного сахара фукозы и фукоолигосахаридов, играющих важную биологическую роль в метаболизме живых организмов. Одним из способов их получения является биодеструкция природных полимеров под действием ферментов. Так, фукоиданы, доля которых значительна в составе такого доступного и дешевого сырья как бурые водоросли, представляют собой полисахариды с мономерным звеном в виде фукозы и некоторых других сахаров и могут быть подвергнуты биоразложению под действием фермента фукозидазы. Производство в промышленных масштабах данных сахаров не развито. Таким образом, разработка и изучение биореакторов на основе иммобилизованных фукозидаз является крайне актуальной задачей. Разработки в данной области находятся на начальных этапах и требуют проведения исследований активности и оптимизации условий, как применения, так и получения биореакторов. Кроме того, необходимо проведение мониторинга протекающих процессов биодеструкции, а также разделения субстрата и продуктов. Часто и успешно применяемым для решения подобных задач методом является высокоэффективная жидкостная хроматография, позволяющая идентифицировать вещества с их одновременным разделением на фракции.
Однако использование ферментов напрямую, то есть путем добавления в реакционную смесь, сопряжено с рядом проблем. Среди них необходимость тщательно следить за оптимальностью условий проведения реакции ввиду чувствительности к ним фермента - белковая молекула должна сохранять в них свою структуру, не подвергаться денатурации. Помимо этого, возникают дополнительные стадии очисти продуктов от фермента, что усложняет процесс с технологической точки зрения.
Решением возникших проблем стала иммобилизация - связывание фермента за счет ковалентных связей или нековалентных взаимодействий с носителями, чаще всего твердофазными, что позволило значительно повысить стабильность белковой молекулы и расширить границы условий ее применения для катализа. Физические методы иммобилизация (например, адсорбция) просты в исполнении, дают хорошие результаты, хотя не исключают вымывание фермента с поверхности в ходе эксплуатации. Формирование ковалентных связей между ферментом и матрицей позволяет получить более надежные биокатализаторы, дольше сохраняющие свою активность на первоначальном уровне. Кроме того, иммобилизацию можно проводить не напрямую, а через так называемый спейсер - промежуточной соединение, позволяющее отдалить фермент от поверхности. Последний подход сложнее, но позволяет имитировать для фермента состояние близкое к таковому в растворе, сделать активный центр более доступным для субстрата и исключить нековалентные взаимодействия с носителем.
Кроме повышения стабильности, преимуществом иммобилизации является простота отделения биокатализатора от реакционной смеси. Особенно удобны в этом плане биокатилитические системы в виде проточных реакторов, например, хроматографические колонки и диски, заполненные твердой фазой. В первоначальных вариантах носитель чаще всего был представлен в виде гранул - пористых или непористых частиц. В 90-х годах прошлого века был разработан принципиально новый класс твёрдых носителей, а именно макропористые монолитные материалы, представляющие собой единый полимерный блок, пронизанный системой взаимосвязанных капилляров - макропор.
Для заполненных колонок значительную роль играл диффузионный перенос вещества к поверхности носителя и в его поры, что не позволяло использовать высокие скорости потока раствора субстрата через стационарную фазу. В отличие от предшественников, для монолитных материалов преобладает конвективный массоперенос, способствующий снижению сопротивления потоку подвижной фазы и повышению эффективности межфазовых процессов в системе. В связи с этим, разработка методов синтеза макропористых материалов монолитного типа с прогнозируемой поровой структурой и функциональностью представляет собой одно из перспективных направлений в области создания стационарных фаз для реализации гетерогенного биокатализа. Для создания матриц с желаемыми характеристиками, включая размер пор, гидрофильно-гидрофобные свойства поверхности и требуемую функциональность хорошо себя зарекомендовали полиметакрилатные носители.
Исходя из вышеизложенного, целью данной работы являлось получение гетерогенных биокатализаторов на основе макропористых монолитных материалов с иммобилизованной на их поверхности фукозидазой, а также изучение свойств полученных систем
Для достижения данной цели были поставлены следующие задач:
• синтез макропористых полиметакрилатных материалов монолитного типа в форме хроматографических колонок с желаемыми поровыми характеристиками;
• проведение иммобилизации фукозидазы на поверхности макропористых материалов монолитного типа двумя способами: прямым методом и через спейсер;
• исследование каталитической активности иммобилизованных ферментов;
• оптимизация условий разделения субстрата, фукоидана, и продукта его гидролиза, фукозы, методом ВЭЖХ для последующего мониторинга биокаталитического процесса.
ВЫВОДЫ
1. Исследована возможность управления поровой структурой монолитного материала на основе сополимера ГМА-ГЭМА-ЭДМА за счет изменения состава полимеризационной смеси и условий проведения синтеза. Установлено, что оптимальная температура полимеризации составляет 65 °C, время полимеризации - 6 часов, а содержание инициатора - 0.7-1.О масс%. Продемонстрировано влияние природы и соотношения порогенов в реакционной смеси на поровую структуру материала. Получен ряд макропористых монолитных материалов в форме стержней с требуемым размером пор, составляющим примерно 1100 нм.
2. Проведена иммобилизация фукозидазы на поверхности макропористых монолитных материалов двумя способами: прямой иммобилизацией и через высокомолекулярный спейсер. Для прямого метода иммобилизации на поверхности материалов различного дизайна (диски и стержни) получены приемлемые результаты, в то время как методика иммобилизации фукозидазы через спейсер требует дальнейшей оптимизации.
3. Исследована каталитическая активность нативной и иммобилизованной а- фукозидазы и показано, что при иммобилизации фермент частично теряет свою активность, что согласуется с теоретическими представлениями. Тем не менее, после иммобилизации активность фермента составляла около 60% от исходного уровня, что, учитывая возможность многократного использования гетерогенного биокатализатора, является достаточным для практического применения.
4. Положено начало работе по исследованию возможности мониторинга ферментативного гидролиза фукоидана методом анионообменной ВЭЖХ в условиях градиентного элюирования. Проведено разделение смеси фукозы (продукт полной деструкции фукоидана) и фукоидана (субстрат), представляющих собой два крайних по свойствам компонента анализируемой смеси.
1. Исследована возможность управления поровой структурой монолитного материала на основе сополимера ГМА-ГЭМА-ЭДМА за счет изменения состава полимеризационной смеси и условий проведения синтеза. Установлено, что оптимальная температура полимеризации составляет 65 °C, время полимеризации - 6 часов, а содержание инициатора - 0.7-1.О масс%. Продемонстрировано влияние природы и соотношения порогенов в реакционной смеси на поровую структуру материала. Получен ряд макропористых монолитных материалов в форме стержней с требуемым размером пор, составляющим примерно 1100 нм.
2. Проведена иммобилизация фукозидазы на поверхности макропористых монолитных материалов двумя способами: прямой иммобилизацией и через высокомолекулярный спейсер. Для прямого метода иммобилизации на поверхности материалов различного дизайна (диски и стержни) получены приемлемые результаты, в то время как методика иммобилизации фукозидазы через спейсер требует дальнейшей оптимизации.
3. Исследована каталитическая активность нативной и иммобилизованной а- фукозидазы и показано, что при иммобилизации фермент частично теряет свою активность, что согласуется с теоретическими представлениями. Тем не менее, после иммобилизации активность фермента составляла около 60% от исходного уровня, что, учитывая возможность многократного использования гетерогенного биокатализатора, является достаточным для практического применения.
4. Положено начало работе по исследованию возможности мониторинга ферментативного гидролиза фукоидана методом анионообменной ВЭЖХ в условиях градиентного элюирования. Проведено разделение смеси фукозы (продукт полной деструкции фукоидана) и фукоидана (субстрат), представляющих собой два крайних по свойствам компонента анализируемой смеси.
