Тема: МИКРОЭКСТРАКЦИОННОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ И НЕСТЕРОИДНЫХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
📋 Содержание
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1 Общая характеристика фторхинолонов, сульфаниламидов, тетрациклинов и
диклофенака 11
1.2 Микроэкстракционные методы 16
1.2.1 Жидкостная микроэкстракция 17
1.2.2 Твердофазная микроэкстракция 36
1.2.3 Автоматизация жидкостной и твердофазной микроэкстракции для определения
фторхинолонов, сульфаниламидов, тетрациклинов и нестероидных
противовоспалительных лекарственных веществ 49
1.3 Основные методы определения фторхинолонов, сульфаниламидов,
тетрациклинов и нестероидных противовоспалительных лекарственных веществ 65
Заключение 69
Глава 2 Методика экспериментальных исследований 71
2.1 Средства измерений и оборудование 71
2.2 Реактивы и приготовление растворов 72
2.3 Пробоотбор и предварительная подготовка лекарственных препаратов,
биологических жидкостей и тканей животного происхождения 74
2.4 Условия определения и микроэкстракционного выделения фторхинолонов,
тетрациклинов, сульфаниламидов и диклофенака 76
2.4.1 Условия хроматографического определения фторхинолонов, тетрациклинов и
сульфаниламидов 76
2.4.2 Условия микроэкстракционного выделения фторхинолонов, сульфаниламидов
и тетрациклинов для последущего хроматографического анализа 78
2.4.3 Условия автоматизированного хемилюминесцентного скрининг-определения
фторхинолонов в биологических жидкостях с предварительным их выделением на ферромагнитных наночастицах 80
2.4.4 Условия экстракционно-фотометрического определения диклофенака в
лекарственных препаратах и слюне 81
Глава 3 Хроматографическое определение лекарственных веществ с микроэкстракционным выделением в экстрагенты с «переключаемой гидрофильностью» 82
Глава 4 Проточное хемилюминесцентное определение общего содержания фторхинолонов в биологических жидкостях с выделением на ферромагнитных наночастицах 133
Глава 5 Проточное экстракционно-фотометрическое определение диклофенака
в лекарственных препаратах и слюне 144
Заключение 153
Список сокращений и условных обозначений 156
Список литературы 158
Приложение 206
📖 Введение
Как правило, сложный и многокомпонентный состав перечисленных выше объектов и зачастую низкие концентрации целевых аналитов требуют включения в общую схему анализа стадий их выделения и концентрирования. В последнее время для выделения ЛВ из различных матриц активно применяются методы жидкостной и твердофазной микроэкстракции, позволяющие упростить процедуры пробоподготовки, обеспечивая ее высокую эффективность при минимальных расходах реагентов и проб. Кроме того, повысить экспрессность и воспроизводимость фармацевтического анализа и снизить его трудозатраты можно путем автоматизации процедур пробоподготовки на принципах проточных методов, которые в случае ряда антибактериальных и нестероидных противовоспалительных ЛС имеют ограниченное применение на практике.
Научным консультантом по диссертационной работе являлся д.х.н., проф. Гармонов Сергей Юрьевич
Диссертационная работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (16-33-00037 мол а, 18-33-01176мол а, 18-33-20004 мол а вед), Правительства Санкт-Петербурга (распоряжения Комитета по науке и высшей школе от 27.11.2015 №134, от 28.11.2016 №148 и от 17.11.2017 №167) и Visegrad Scholarship Program (Visegrad Scholarship ID 51600237 от 03.06.2016).
Цель работы состояла в разработке новых эффективных схем определения фторхинолонов, сульфаниламидов, тетрациклинов и диклофенака натрия в лекарственных препаратах, биологических жидкостях, органах и тканях животного происхождения на основе использования жидкостной и твердофазной микроэкстракции.
Для достижения цели решались следующие задачи:
- оптимизировать условия хроматографического разделения и детектирования фторхинолонов, сульфаниламидов и тетрациклинов в варианте обращенно-фазовой жидкостной хроматографии;
- обосновать возможность применения ди-(2-этилгексил)-фосфорной кислоты и глубоких эвтектических растворителей (ГЭР) на основе тимола и высших карбоновых кислот в качестве экстрагентов с «переключаемой гидрофильностью» для реализации жидкостной микроэкстракции из гомогенного раствора; при этом оценить их экстрагирующую способность по отношению к целевым ЛВ, а также выявить условия, необходимые для образования гомогенного раствора экстрагента с пробой, и найти эффективные способы инициирования фазового разделения и массопереноса;
- разработать гидравлические схемы для автоматизации процедур микроэкстракционного выделения, концентрирования целевых ЛВ и предложить подходы к жидкостной микроэкстракции в экстрагенты с «переключаемой гидрофильностью» на импрегнированных мембранах и с выделением дисперсной фазы экстрагента на вращающемся пористом гидрофобном диске после ее in situ образования;
- оптимизировать условия автоматизированного хемилюминесцентного определения фторхинолонов в условиях проточной мультинасосной системы с предварительным сорбционным выделением на ферромагнитных наночастицах и подобрать состав элюента, совместимый с разработанной системой;
- оптимизировать условия дериватизации диклофенака для его проточного экстракционно-фотометрического определения с применением оптоволоконного зонда;
- апробировать разработанные подходы при анализе реальных объектов и подтвердить правильность получаемых результатов референтными методами.
Научная новизна:
- для автоматизированного определения фторхинолонов в гомогенных растворах (лекарственные препараты, моча) разработана гидравлическая схема, включающая их жидкостную микроэкстракцию из гомогенного раствора пробы в экстрагент с «переключаемой гидрофильностью»;
- для определения фторхинолонов в суспендированных пробах (лекарственные препараты, ткани животного происхождения) разработан новый метод, предполагающий микроэкстракционное выделение на мембранах, импрегнированных экстрагентами с «переключаемой гидрофильностью» (высшими карбоновыми кислотами);
- предложен метод экспрессного микроэкстракционного концентрирования тетрациклинов, включающий in situобразование дисперсной фазы экстрагента с «переключаемой гидрофильностью» с ее одновременным выделением на вращающемся пористом гидрофобном диске;
- для микроэкстракционного выделения сульфаниламидов из сложных матриц предложены новые экстрагенты с «переключаемой гидрофильностью»: ди-(2-этилгексил)-фосфорная кислота и ГЭР на основе тимола и высших карбоновых кислот;
- для автоматизированного определения сульфаниламидов в лекарственных препаратах и моче разработана гидравлическая схема, включающая их жидкостную микроэкстракцию из гомогенного раствора пробы в ди-(2- этилгексил)-фосфорную кислоту непосредственно в камере шприцевого насоса;
- для автоматизированного спектрофотометрического определения диклофенака в лекарственных препаратах и слюне разработана гидравлическая схема, включающая его дериватизацию, экстракцию дериватива и детектирование в экстракте с помощью оптоволоконного зонда;
- разработан новый подход к проточному хемилюминесцентому скрининг- определению фторхинолонов в биологических жидкостях, предполагающий концентрирование аналитов на ферромагнитных наночастицах.
Теоретическая и практическая значимость состоит в том, что разработаны новые способы высокочувствительного определения фторхинолонов, сульфаниламидов и тетрациклинов в лекарственных препаратах, биологических жидкостях, тканях животного происхождения методами высокоэффективной жидкостной хроматографии с фотометрическим (ВЭЖХ-УФ) и флуориметрическим (ВЭЖХ-ФЛ) детектированием, включающие микроэкстракционное выделение аналитов. На их основе предложены схемы автоматизированного экстракционно-фотометрического определения диклофенака в лекарственных препаратах, слюне и автоматизированного хемилюминесцентного скрининг-определения фторхинолонов в биологических жидкостях, обеспечивающие высокую чувствительность и прецизионность анализа.
Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры аналитической химии ФГБОУ ВО «Санкт Петербургский государственный университет», НОЦ фармацевтики ФГАО ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (приложение).
Методология и методы исследований. Для определения лекарственных веществ использовали методы ВЭЖХ-УФ, ВЭЖХ-ФЛ, ВЭЖХ-МС/МС (высокоэффективная жидкостная хроматография и тандемная масс- спектрометрия), спектрофотометрию, флуориметрию, мультинасосный проточный анализ с хемилюминесцентным детектированием, циклический инжекционный анализ с фотометрическим детектированием.
Положения, выносимые на защиту:
- автоматизированный метод пробоподготовки для ВЭЖХ-ФЛ определения офлоксацина в гомогенных растворах (лекарственные препараты, моча), предполагающий микроэкстракционное выделение в экстрагент с «переключаемой гидрофильностью»;
- эффективный подход к микроэкстракционному выделению фторхинолонов
из суспендированных проб (лекарственные препараты, ткани животного происхождения) на мембранах, импрегнированных экстрагентами с «переключаемой гидрофильностью» для их последующего ВЭЖХ-ФЛ определения;
- принцип экспрессного микроэкстракционного концентрирования тетрациклинов, основанный на in situобразовании дисперсной фазы экстрагента с «переключаемой гидрофильностью» с ее одновременным выделением на вращающемся пористом гидрофобном диске, для их последующего ВЭЖХ-УФ определения в лекарственных препаратах и моче;
- обоснование возможности применения ди-(2-этилгексил)-фосфорной кислоты и ГЭР на основе тимола и высших карбоновых кислот в качестве экстрагентов с «переключаемой гидрофильностью» для реализации жидкостной микроэкстракции сульфаниламидов из лекарственных препаратов и мочи в камере шприцевого насоса проточного анализатора и статических условиях для их последующего ВЭЖХ-УФ определения;
- принцип регистрации оптической плотности органической фазы
посредством оптоволоконного зонда в условиях жидкостной экстракции для автоматизированного экстракционно-фотометрического определения диклофенака в лекарственных препаратах и слюне;
- метод проточного хемилюминесцентного определения общего содержания фторхинолонов в молоке с предварительным концентрированием аналитов на ферромагнитных наночастицах;
- метрологические характеристики разработанных способов анализа и результаты их испытаний в фармацевтическом анализе.
Степень достоверности и апробация результатов работы. Достоверность полученных результатов обеспечена использованием современных методов ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-ФЛ, спектрофотометрии, хемилюминесцентного и проточного анализа, а также математической статистики при обработке экспериментальных данных.
Результаты работы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Всероссийской студенческой конференции-конкурсе «Химия молодым» (Санкт-Петербург, 2015), IX международной конференции среди молодых ученых по химии «Mendeleev — 2015» (Санкт-Петербург, 2015), III Всероссийской студенческой конференции с международным участием «Химия и химическое образование XXI века» (Санкт-Петербург, 2015), международной конференции «Flow analysis XIII» (Прага, Чехия, 2015), международной студенческой конференции «Science and Progress-2015» (Санкт-Петербург, 2015), XIX Всероссийской конференции молодых ученых-химиков (Нижний Новгород, 2016), XX международной конференции «International Conference on Flow Injection Analysis and Related Techniques» (Пальма-де-Майорка, Испания, 2016), X международной конференции среди молодых ученых по химии «Mendeleev — 2017» (Санкт-Петербург, 2017), международном конгрессе «IUPAC International Congress on Analytical Sciences 2017» (Хайкоу, Китай, 2017), XXI международной конференции «International Conference on Flow Injection Analysis and Related Techniques» (Санкт-Петербург, 2017), III международной конференции «International Caparica Christmas Conference on Sample Treatment» (Кошта-да- Капарика, Португалия, 2018), XI международной конференции среди молодых ученых по химии «Mendeleev — 2019» (Санкт-Петербург, 2019).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области специальности, конкретно п. 3,4 паспорта специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».
Публикации. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 19 печатных изданиях, включая 7 статей в рецензируемых изданиях, рекомендуемых для размещения материалов диссертаций и 12 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, заключения, списка литературы, включающего 390 источников. Работа изложена на 205 страницах машинописного текста, иллюстрирована 82 рисунками и 22 таблицами.
Личный вклад автора. Автор принимал участие в обсуждении цели и задач исследования, выборе и обосновании методик эксперимента. Экспериментальные исследования выполнены лично автором. Автор активно участвовал в анализе и обобщении полученных экспериментальных результатов, установлении закономерностей и формулировке выводов, написании статей, подготовке и представлении докладов на Всероссийских и международных конференциях.
Благодарности. Автор работы выражает глубокую благодарность научному руководителю д.х.н., профессору РАН А.В. Булатову, научному консультанту д.х.н., профессору С.Ю. Гармонову, к.х.н., доценту К.С. Вах и к.х.н., доценту И.И. Тимофеевой за руководство и помощь при выполнении и написании работы; Dr. Prof. V. Andruch и Dr. S. Koronkiewicz за помощь при выполнении исследований в области автоматизации процедур пробоподготовки; к.х.н., доценту Е.А. Бессоновой и С.А. Лебединец за помощь при оптимизации условий хроматографического анализа; ресурсному центру СПбГУ «Методы анализа состава вещества».
✅ Заключение
1. Оптимизированы условия хроматографического разделения и детектирования фторхинолонов, сульфаниламидов и тетрациклинов в варианте обращено-фазовой жидкостной хроматографии со спектрофотрическим и флуориметрическим детектированием с учетом растворимости экстрактов в подвижных фазах и чувствительности определения. Общее время ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-ФЛ анализа не превышает 25 мин;
2. Разработана гидравлическая схема, включающая жидкостную микроэкстракцию офлоксацина из гомогенного раствора пробы (лекарственные препараты, моча) в высшие карбоновые кислоты для его ВЭЖХ-ФЛ определения. Для быстрого фазового разделения в условиях проточного анализа успешно реализована идея разрушения эмульсий пузырьками углекислого газа, которые образуются in situв экстракционной системе. Достигнута высокая эффективность выделения офлоксацина (степень извлечения - 90±5% (n=3)). Предел обнаружения составил 4 мкг/л.
3. Предложен эффективный подход к микроэкстракционному выделению фторхинолонов из суспендированных проб (лекарственные препараты, ткани животного происхождения) на мембранах, импрегнированных экстрагентами с «переключаемой гидрофильностью» для их последующего ВЭЖХ-ФЛ определения. Степени извлечения достигают 83-87 %. Пределы обнаружения находятся в диапазоне от 1 до 5 мкг/л.
4. Установлено, что предложенный принцип микроэкстракционного концентрирования, основанный на in situобразовании дисперсной фазы экстрагента с «переключаемой гидрофильностью» с ее одновременным выделением на вращающемся пористом гидрофобном диске, позволяет существенно повысить экспрессность пробоподготовки по сравнению с мембранной микроэкстракцией, сокращая время извлечения с 30 до 5 мин. Возможности предложенного подхода были продемонстрированы для ВЭЖХ-УФ определения тетрациклинов в лекарственных препаратах и моче с пределом обнаружения 30 мкг/л.
5. Подтверждена возможность применения ди-(2-этилгексил)-фосфорной кислоты и ГЭР на основе тимола и высших карбоновых кислот в качестве экстрагентов с «переключаемой гидрофильностью» для проведения жидкостной микроэкстракции из гомогенного раствора. Установлено, что в случае ди-(2- этилгексил)-фосфорной кислоты разделение фаз протекает относительно быстро и самопроизвольно, что позволило реализовать автоматизированный экстракционный процесс в смесительной камере проточного анализатора с высокой экспрессностью (длительность пробоподготовки - 5 мин) для извлечения сульфаниламидов из лекарственных препаратов и мочи. В свою очередь, ГЭР на основе тимола и высших карбоновых кислот обеспечивают более высокие коэффициенты концентрирования сульфаниламидов, и как следствие более низкие пределы их обнаружения (от 1 до 5 мкг/л).
6. Оптимизированы условия скрининг-анализа биологических жидкостей в условиях проточной мультинасосной системы с предварительным сорбционным выделением на ферромагнитных наночастицах для автоматизированного хемилюминесцентного определения общего содержания фторхинолонов. Раствор аммиака в метаноле был предложен и обоснован в качестве эффективного элюента для последующего хемилюминесцентного детектирования аналитов. В оптимизированных условиях сорбционного выделения и детектирования фторхинолонов предел обнаружения в пересчете на содержание флероксацина составил 30 мкг/кг.
7. Установлены условия дериватизации диклофенака в присутствии гексацианоферрата(Ш) калия в щелочной среде для его последующего автоматизированного экстракционно-фотометрического определения в лекарственных препаратах и слюне. Полный цикл анализа автоматизирован в условиях проточной системы и занимает 3 мин. Продемонстрированы возможности оптоволоконного зонда при регистрации оптической плотности органической фазы сразу после фазового разделения в случае образования неустойчивой аналитической формы. Предел обнаружения диклофенака составил 0,24 мг/л.
8. Разработанные подходы были успешно апробированы при анализе лекарственных препаратов, биологических жидкостей и тканей животного происхождения с подтверждением правильности получаемых результатов референтными методами флуориметрии, ВЭЖХ-УФ, ВЭЖХ-ФЛ и ВЭЖХ- МС/МС.
Предложенные принципы осуществления микроэкстракционного выделения и концентрирования, в том числе в автоматизированных системах, показали высокую эффективность и экспрессность при проведении пробоподготовки. Несмотря на то, что возможности разработанных методов показаны на примере конкретных аналитов или их групп, каждый из них может найти применение в фармацевтическом анализе для определения широкого круга ЛВ. Необходимо отметить, что предложенные экстрагенты с «переключаемой гидрофильностью» обладают хорошей экстрагирующей способностью по отношению ко всем рассмотренным классам антибактериальных агентов и их область применения не ограничивается выбранными для иллюстрации аналитами.
На основании полученных результатов, можно сделать вывод, что в рамках диссертационной работы разработан комплекс методов фармацевтического анализа, пригодный для решения разнообразных задач. В целом выбор метода микроэкстракции зависит от анализируемого объекта и концентраций целевых аналитов в нем. Среди разработанных способов определения ЛВ автоматизированные схемы наиболее совместимы с жидкими пробами. Для твердофазных и суспендированных проб предпочтительным является метод мембранной микроэкстракции, так как при этом предварительное переведение аналитов в раствор не требуется, а мембрана минимизирует контакт между органической фазой и твердыми компонентами пробы. Предложенные подходы также различаются по коэффициентам концентрирования, что следует учитывать при определении низких концентраций аналитов.



