Регенеративный потенциал клеток кожи
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ 7
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Морфофункциональная характеристика кожи человека 8
1.2 Физиологическая и репаративная регенерация кожи. Стволовые ниши 19
1.3 Фенотипическая характеристика фибробластов (ФБ) и кератиноцитов (КЦ) 26
1.4 Кожные раны 29
1.5 Методы лечения кожных ран 31
1.6 Раневые покрытия (РП) в лечении кожных ран 32
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39
2.1 Получение первичных культур ФБ и КЦ кожи человека 39
2.2 Стандартные условия культивирования 40
2.3 Оценка морфологического состояния культивируемых клеток 40
2.4 Оценка пролиферативной активности по индексу пролиферации 40
2.5 Анализ эффективности колониеобразования 41
2.6 Анализ репликативного старения 41
2.7 Иммуноцитохимический анализ 42
2.8 Цитогенетический анализ полученных линий ФБ 43
2.9 Моделирование мезенхимально-эпителиального перехода КЦ (эпителиальная дифференцировка) 44
2.10 Криоконсервация и реконсервация ФБ и КЦ 45
2.11 Приготовление дермального и эпидермального эквивалентов кожи на основе коллагенового геля 45
2.12 Колориметрические методы оценки пролиферативной активности клеток в составе эквивалентов кожи на основе коллагенового геля 46
2.12.1 МТТ-тест 46
2.12.2 Резазурин-тест 47
2.13 Анализ биосовместимости коммерческих раневых покрытий с дермальным эквивалентом на основе коллагенового геля 48
2.14 Гистологическое исследование тонкой кожи человека 49
2.15 Клинические исследования применения дермального и эпидермального эквивалентов кожи при терапии кожных ран 50
2.16 Обработка полученных данных 50
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 52
3.1 Гистологическое исследование тонкой кожи человека 52
3.2 Получение клеточных культур ФБ и КЦ кожи человека 53
3.3 Оценка пролиферативной активности ФБ и КЦ на основании данных по способности к колониеобразованию и индексу пролиферации 55
3.4 Репликативное клеточное старение ФБ и КЦ 56
3.5 Цитогенетический анализ полученных линий ФБ кожи человека 57
3.6 Маркерный профиль выделенных культур ФБ и КЦ 64
3.7 Моделирование мезенхимально-эпителиального перехода КЦ in vitro 68
3.8 Исследование жизнеспособности клеточной составляющей эквивалентов кожи на основе коллагенового геля 69
3.9 Анализ биосовместимости коммерческих раневых покрытий с ТБП «Эквивалент дермальный ЭД» 73
3.10 Клинические исследования применения дермального и эпидермального эквивалентов кожи при терапии кожных ран 75
Выводы 79
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 80
БЛАГОДАРНОСТИ 92
ВВЕДЕНИЕ 5
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ 7
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Морфофункциональная характеристика кожи человека 8
1.2 Физиологическая и репаративная регенерация кожи. Стволовые ниши 19
1.3 Фенотипическая характеристика фибробластов (ФБ) и кератиноцитов (КЦ) 26
1.4 Кожные раны 29
1.5 Методы лечения кожных ран 31
1.6 Раневые покрытия (РП) в лечении кожных ран 32
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39
2.1 Получение первичных культур ФБ и КЦ кожи человека 39
2.2 Стандартные условия культивирования 40
2.3 Оценка морфологического состояния культивируемых клеток 40
2.4 Оценка пролиферативной активности по индексу пролиферации 40
2.5 Анализ эффективности колониеобразования 41
2.6 Анализ репликативного старения 41
2.7 Иммуноцитохимический анализ 42
2.8 Цитогенетический анализ полученных линий ФБ 43
2.9 Моделирование мезенхимально-эпителиального перехода КЦ (эпителиальная дифференцировка) 44
2.10 Криоконсервация и реконсервация ФБ и КЦ 45
2.11 Приготовление дермального и эпидермального эквивалентов кожи на основе коллагенового геля 45
2.12 Колориметрические методы оценки пролиферативной активности клеток в составе эквивалентов кожи на основе коллагенового геля 46
2.12.1 МТТ-тест 46
2.12.2 Резазурин-тест 47
2.13 Анализ биосовместимости коммерческих раневых покрытий с дермальным эквивалентом на основе коллагенового геля 48
2.14 Гистологическое исследование тонкой кожи человека 49
2.15 Клинические исследования применения дермального и эпидермального эквивалентов кожи при терапии кожных ран 50
2.16 Обработка полученных данных 50
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 52
3.1 Гистологическое исследование тонкой кожи человека 52
3.2 Получение клеточных культур ФБ и КЦ кожи человека 53
3.3 Оценка пролиферативной активности ФБ и КЦ на основании данных по способности к колониеобразованию и индексу пролиферации 55
3.4 Репликативное клеточное старение ФБ и КЦ 56
3.5 Цитогенетический анализ полученных линий ФБ кожи человека 57
3.6 Маркерный профиль выделенных культур ФБ и КЦ 64
3.7 Моделирование мезенхимально-эпителиального перехода КЦ in vitro 68
3.8 Исследование жизнеспособности клеточной составляющей эквивалентов кожи на основе коллагенового геля 69
3.9 Анализ биосовместимости коммерческих раневых покрытий с ТБП «Эквивалент дермальный ЭД» 73
3.10 Клинические исследования применения дермального и эпидермального эквивалентов кожи при терапии кожных ран 75
Выводы 79
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 80
БЛАГОДАРНОСТИ 92
Кожа - самый большой и тяжелый орган в организме человека. Она представляет собой непрерывный комплексный покров тела, образованный тремя различными по происхождению, строению и функциям слоями: эпидермисом, дермой и гиподермой, находящимися в морфофункциональном единстве (Афанасьев и др., 2018; Кузнецов и Мушкамбаров, 2007; Быков, 1997; Мяделец, 2016; Боровик и др., 2010; Mescher, 2018). Кожа является сложной многофункциональной структурой, функции которой связаны с поддержанием внутреннего баланса и защитой от факторов внешней среды. Находясь на границе между системой внутренних органов и внешней средой, она подвергается постоянной нагрузке и нуждается в обновлении и восстановлении.
В коже были идентифицированы многочисленные популяции стволовых клеток (СК), которые играют жизненно важную роль в ее развитии. В настоящее время в коже человека выделяют несколько ниш СК: эпителиальная (эпидермальная), дермальная и жировая (Волкова и др., 2014; Shevchenko et al., 2010; Shpichka et al., 2019). В гомеостатических условиях каждая популяция СК действует однонаправленно - поддерживая соответствующую территорию. После травмы, когда системная и локальная среды резко меняются, популяции СК демонстрируют высокую пластичность (Adam et al., 2015; Ge et al., 2017). Даже если их собственная ниша не нарушена, близлежащие СК реагируют на вызванные раной стимулы, выходя из своей ниши и участвуя в реэпителизации поврежденной ткани (Ito et al., 2005; Levy et al., 2005; Lu et al., 2012; Nowak et al., 2008).
Однако в процессе заживления кожной раны могут возникнуть осложнения, в следствии которых на месте острой раны может возникнуть хроническая рана или чрезмерное рубцевание; кроме того, сложности вызывают обширные ожоговые повреждения кожи. На данный момент самыми распространенными и экономически затратными в лечении являются термические и трофические кожные раны (Fife & Carter, 2012; Sen et al., 2009).
Лечение кожной раны в основном включает её быстрое закрытие для восстановления барьерной функции кожи и предотвращения инфекции, а также подавление боли и функциональное восстановление. В настоящее время выделяют оперативный, консервативный и комбинированный методы лечения кожных ран, а современные методики варьируют от традиционных до альтернативных. Однако, независимо от вида кожной раны основным подходом в её лечении является использование перевязочных материалов и раневых покрытий (РП), которые защитят рану от пересыхания и инфекции, обеспечат обезболивание и ускорят заживление (Atiyeh et al., 2005; Shi et al., 2020; Weller et al., 2020). РП являются относительно новыми биомедицинскими продуктами, и в настоящее время не существует общепринятой классификации раневых покрытий. Множество современных РП можно разделить на 3 большие группы: влагоудерживающие РП (представляют собой пленки, гидрогели, гидроколлоиды, пены, альгинаты), антимикробные РП (содержат серебро, мед, йод) и тканеинженерные биологические покрытия (ТБП). ТБП - это заменители, или эквиваленты кожи (ЭК), компенсирующие функциональные и физиологические нарушения, присутствующие в поврежденных тканях (Broussard & Powers, 2013). Тканеинженерные биологические покрытия представляют собой биомедицинский клеточный продукт (БМКП). При их создании, как правило, используют фибробласты кожи (ФБ) и/или кератиноциты (КЦ), заселенные на различные носители (Shevchenko et al., 2010; Shpichka et al., 2019). КЦ, являясь основным клеточным компонентом эпидермиса, отвечают за его стратифицированную структуру и образуют многочисленные узкие межклеточные соединения. ФБ, являясь основным клеточным типом дермы, производят компоненты внеклеточного матрикса (ВКМ) и выделяют различные факторы роста, цитокины и матричные металлопротеиназы, которые обеспечивают образование ВКМ, а также пролиферацию и дифференциацию КЦ (Wang et al., 2007). Трансплантация ФБ и КЦ в составе ТБП может способствовать сокращению сроков лечения обширных и хронических ран за счет более раннего восстановления кожного покрова, что позволит снизить длительность системной антибактериальной терапии и необходимость назначения аутодермопластики. Это позволит повысить выживаемость пациентов в тяжёлых случаях и улучшить качество жизни (Boateng et al., 2008; Nicholas & Yeung, 2017; Oryan et al., 2017). Одним из перспективных ТБП является разработанный в Институте цитологии РАН БМКП «Эквивалент дермальный ЭД», состоящий из коллагенового геля (КГ) с заключёнными в него ФБ. Использование КЦ при разработках ТБП ограничено сложностями выращивания в условиях in vitro многослойного пласта.
Следует отметить, что применение ТБП в клинической практике сопряжено с применением различных перевязочных материалов и РП в качестве вторичного покрытия. Выбор вторичных РП является актуальной проблемой и должен основываться не только на особенностях раны, но и на биосовместимости с ТБП.
Рациональный подход заключается как в разработке различных ТБП (эквивалентов кожи), так и методик их применения в клинике. Несмотря на почти полувековую историю разработок эквивалентов кожи, к настоящему времени остается много вопросов, связанных как с требованиями к компонентам ЭК при их приготовлении, так и с технологией их применения. Отсутствие на сегодняшний день оптимальных протоколов приготовления различных эквивалентов кожи и их применения отдельно и совместно с другими раневыми покрытиями побудило нас на это исследование.
В коже были идентифицированы многочисленные популяции стволовых клеток (СК), которые играют жизненно важную роль в ее развитии. В настоящее время в коже человека выделяют несколько ниш СК: эпителиальная (эпидермальная), дермальная и жировая (Волкова и др., 2014; Shevchenko et al., 2010; Shpichka et al., 2019). В гомеостатических условиях каждая популяция СК действует однонаправленно - поддерживая соответствующую территорию. После травмы, когда системная и локальная среды резко меняются, популяции СК демонстрируют высокую пластичность (Adam et al., 2015; Ge et al., 2017). Даже если их собственная ниша не нарушена, близлежащие СК реагируют на вызванные раной стимулы, выходя из своей ниши и участвуя в реэпителизации поврежденной ткани (Ito et al., 2005; Levy et al., 2005; Lu et al., 2012; Nowak et al., 2008).
Однако в процессе заживления кожной раны могут возникнуть осложнения, в следствии которых на месте острой раны может возникнуть хроническая рана или чрезмерное рубцевание; кроме того, сложности вызывают обширные ожоговые повреждения кожи. На данный момент самыми распространенными и экономически затратными в лечении являются термические и трофические кожные раны (Fife & Carter, 2012; Sen et al., 2009).
Лечение кожной раны в основном включает её быстрое закрытие для восстановления барьерной функции кожи и предотвращения инфекции, а также подавление боли и функциональное восстановление. В настоящее время выделяют оперативный, консервативный и комбинированный методы лечения кожных ран, а современные методики варьируют от традиционных до альтернативных. Однако, независимо от вида кожной раны основным подходом в её лечении является использование перевязочных материалов и раневых покрытий (РП), которые защитят рану от пересыхания и инфекции, обеспечат обезболивание и ускорят заживление (Atiyeh et al., 2005; Shi et al., 2020; Weller et al., 2020). РП являются относительно новыми биомедицинскими продуктами, и в настоящее время не существует общепринятой классификации раневых покрытий. Множество современных РП можно разделить на 3 большие группы: влагоудерживающие РП (представляют собой пленки, гидрогели, гидроколлоиды, пены, альгинаты), антимикробные РП (содержат серебро, мед, йод) и тканеинженерные биологические покрытия (ТБП). ТБП - это заменители, или эквиваленты кожи (ЭК), компенсирующие функциональные и физиологические нарушения, присутствующие в поврежденных тканях (Broussard & Powers, 2013). Тканеинженерные биологические покрытия представляют собой биомедицинский клеточный продукт (БМКП). При их создании, как правило, используют фибробласты кожи (ФБ) и/или кератиноциты (КЦ), заселенные на различные носители (Shevchenko et al., 2010; Shpichka et al., 2019). КЦ, являясь основным клеточным компонентом эпидермиса, отвечают за его стратифицированную структуру и образуют многочисленные узкие межклеточные соединения. ФБ, являясь основным клеточным типом дермы, производят компоненты внеклеточного матрикса (ВКМ) и выделяют различные факторы роста, цитокины и матричные металлопротеиназы, которые обеспечивают образование ВКМ, а также пролиферацию и дифференциацию КЦ (Wang et al., 2007). Трансплантация ФБ и КЦ в составе ТБП может способствовать сокращению сроков лечения обширных и хронических ран за счет более раннего восстановления кожного покрова, что позволит снизить длительность системной антибактериальной терапии и необходимость назначения аутодермопластики. Это позволит повысить выживаемость пациентов в тяжёлых случаях и улучшить качество жизни (Boateng et al., 2008; Nicholas & Yeung, 2017; Oryan et al., 2017). Одним из перспективных ТБП является разработанный в Институте цитологии РАН БМКП «Эквивалент дермальный ЭД», состоящий из коллагенового геля (КГ) с заключёнными в него ФБ. Использование КЦ при разработках ТБП ограничено сложностями выращивания в условиях in vitro многослойного пласта.
Следует отметить, что применение ТБП в клинической практике сопряжено с применением различных перевязочных материалов и РП в качестве вторичного покрытия. Выбор вторичных РП является актуальной проблемой и должен основываться не только на особенностях раны, но и на биосовместимости с ТБП.
Рациональный подход заключается как в разработке различных ТБП (эквивалентов кожи), так и методик их применения в клинике. Несмотря на почти полувековую историю разработок эквивалентов кожи, к настоящему времени остается много вопросов, связанных как с требованиями к компонентам ЭК при их приготовлении, так и с технологией их применения. Отсутствие на сегодняшний день оптимальных протоколов приготовления различных эквивалентов кожи и их применения отдельно и совместно с другими раневыми покрытиями побудило нас на это исследование.
Выводы
1. Забираемые биоптаты тонкой кожи век человека представлены эпителиально-стромальным комплексом; ферментативное разделение биоптатов на эпидермис и дерму позволило выделить из эпидермиса кератиноциты, а из дермы - фибробласты и получить из них диплоидные клеточные линии. Клетки полученных линий обладают высокой пролиферативной активностью.
2. Фибробласты на всех этапах культивирования представлены клетками мезенхимо-подобного фенотипа, экспрессирующими основные стволовые и мезенхимальные маркеры, что свидетельствует об их стволовости и мезенхимальном происхождении.
3. Полученные линии фибробластов имеют нормальный кариотип 46,X; без клональных численных структурных перестроек; криоконсервация и культивирование до 15 пассажа не оказывают значимого влияния на его стабильность.
4. Кератиноциты первичной культуры представлены популяцией клеток двух фенотипов: эпителио-подобным и мезенхимо-подобным, с преобладанием первого; они характеризуются экспрессией основных стволовых и эпителиальных маркеров, что свидетельствует об их стволовости и эпителиальном происхождении. В процессе культивирования фенотип клеток сменяется на мезенхимо-подобный, что сопровождается снижением уровня экспрессии эпителиальных маркеров и появлением экспрессия N-кадгерина.
5. Индукция эпителиальной дифференцировки выявила способность кератиноцитов мезенхимо-подобного фенотипа совершать мезенхимо-эпителиальный переход и формировать многослойный эпителиальный пласт клеток, экспрессирующих характерные для многослойных эпителиев маркеры.
6. Эквиваленты кожи на основе фибробластов и кератиноцитов, культивируемых внутри коллагенового геля, характеризуются высокой жизнеспособностью клеток обеих линий. Клинические исследования последовательного применения этих эквивалентов совместно с биосовместимыми раневыми покрытиями выявили положительную динамику заживления кожных ран.
1. Забираемые биоптаты тонкой кожи век человека представлены эпителиально-стромальным комплексом; ферментативное разделение биоптатов на эпидермис и дерму позволило выделить из эпидермиса кератиноциты, а из дермы - фибробласты и получить из них диплоидные клеточные линии. Клетки полученных линий обладают высокой пролиферативной активностью.
2. Фибробласты на всех этапах культивирования представлены клетками мезенхимо-подобного фенотипа, экспрессирующими основные стволовые и мезенхимальные маркеры, что свидетельствует об их стволовости и мезенхимальном происхождении.
3. Полученные линии фибробластов имеют нормальный кариотип 46,X; без клональных численных структурных перестроек; криоконсервация и культивирование до 15 пассажа не оказывают значимого влияния на его стабильность.
4. Кератиноциты первичной культуры представлены популяцией клеток двух фенотипов: эпителио-подобным и мезенхимо-подобным, с преобладанием первого; они характеризуются экспрессией основных стволовых и эпителиальных маркеров, что свидетельствует об их стволовости и эпителиальном происхождении. В процессе культивирования фенотип клеток сменяется на мезенхимо-подобный, что сопровождается снижением уровня экспрессии эпителиальных маркеров и появлением экспрессия N-кадгерина.
5. Индукция эпителиальной дифференцировки выявила способность кератиноцитов мезенхимо-подобного фенотипа совершать мезенхимо-эпителиальный переход и формировать многослойный эпителиальный пласт клеток, экспрессирующих характерные для многослойных эпителиев маркеры.
6. Эквиваленты кожи на основе фибробластов и кератиноцитов, культивируемых внутри коллагенового геля, характеризуются высокой жизнеспособностью клеток обеих линий. Клинические исследования последовательного применения этих эквивалентов совместно с биосовместимыми раневыми покрытиями выявили положительную динамику заживления кожных ран.
Подобные работы
- Регенеративный потенциал клеток кожи
Магистерская диссертация, медицина . Язык работы: Русский. Цена: 4940 р. Год сдачи: 2022 - Получение и исследование тканеинженерных раневых покрытий на основе полигидроксиалканоатов
Бакалаврская работа, биология. Язык работы: Русский. Цена: 5600 р. Год сдачи: 2016 - ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭКСТРАКТА СОЛОДКИ ГОЛОЙ НА ПРОЦЕССЫ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА
Диссертация , фармакология . Язык работы: Русский. Цена: 5700 р. Год сдачи: 2003