Тема: Регенеративный потенциал клеток кожи

Кожа - самый большой и тяжелый орган в организме человека. Она представляет собой непрерывный комплексный покров тела, образованный тремя различными по происхождению, строению и функциям слоями: эпидермисом, дермой и гиподермой, находящимися в морфофункциональном единстве (Афанасьев и др., 2018; Кузнецов и Мушкамбаров, 2007; Быков, 1997; Мяделец, 2016; Боровик и др., 2010; Mescher, 2018). Кожа является сложной многофункциональной структурой, функции которой связаны с поддержанием внутреннего баланса и защитой от факторов внешней среды. Находясь на границе между системой внутренних органов и внешней средой, она подвергается постоянной нагрузке и нуждается в обновлении и восстановлении.
В коже были идентифицированы многочисленные популяции стволовых клеток (СК), которые играют жизненно важную роль в ее развитии. В настоящее время в коже человека выделяют несколько ниш СК: эпителиальная (эпидермальная), дермальная и жировая (Волкова и др., 2014; Shevchenko et al., 2010; Shpichka et al., 2019). В гомеостатических условиях каждая популяция СК действует однонаправленно - поддерживая соответствующую территорию. После травмы, когда системная и локальная среды резко меняются, популяции СК демонстрируют высокую пластичность (Adam et al., 2015; Ge et al., 2017). Даже если их собственная ниша не нарушена, близлежащие СК реагируют на вызванные раной стимулы, выходя из своей ниши и участвуя в реэпителизации поврежденной ткани (Ito et al., 2005; Levy et al., 2005; Lu et al., 2012; Nowak et al., 2008).
Однако в процессе заживления кожной раны могут возникнуть осложнения, в следствии которых на месте острой раны может возникнуть хроническая рана или чрезмерное рубцевание; кроме того, сложности вызывают обширные ожоговые повреждения кожи. На данный момент самыми распространенными и экономически затратными в лечении являются термические и трофические кожные раны (Fife & Carter, 2012; Sen et al., 2009).
Лечение кожной раны в основном включает её быстрое закрытие для восстановления барьерной функции кожи и предотвращения инфекции, а также подавление боли и функциональное восстановление. В настоящее время выделяют оперативный, консервативный и комбинированный методы лечения кожных ран, а современные методики варьируют от традиционных до альтернативных. Однако, независимо от вида кожной раны основным подходом в её лечении является использование перевязочных материалов и раневых покрытий (РП), которые защитят рану от пересыхания и инфекции, обеспечат обезболивание и ускорят заживление (Atiyeh et al., 2005; Shi et al., 2020; Weller et al., 2020). РП являются относительно новыми биомедицинскими продуктами, и в настоящее время не существует общепринятой классификации раневых покрытий. Множество современных РП можно разделить на 3 большие группы: влагоудерживающие РП (представляют собой пленки, гидрогели, гидроколлоиды, пены, альгинаты), антимикробные РП (содержат серебро, мед, йод) и тканеинженерные биологические покрытия (ТБП). ТБП - это заменители, или эквиваленты кожи (ЭК), компенсирующие функциональные и физиологические нарушения, присутствующие в поврежденных тканях (Broussard & Powers, 2013). Тканеинженерные биологические покрытия представляют собой биомедицинский клеточный продукт (БМКП). При их создании, как правило, используют фибробласты кожи (ФБ) и/или кератиноциты (КЦ), заселенные на различные носители (Shevchenko et al., 2010; Shpichka et al., 2019). КЦ, являясь основным клеточным компонентом эпидермиса, отвечают за его стратифицированную структуру и образуют многочисленные узкие межклеточные соединения. ФБ, являясь основным клеточным типом дермы, производят компоненты внеклеточного матрикса (ВКМ) и выделяют различные факторы роста, цитокины и матричные металлопротеиназы, которые обеспечивают образование ВКМ, а также пролиферацию и дифференциацию КЦ (Wang et al., 2007). Трансплантация ФБ и КЦ в составе ТБП может способствовать сокращению сроков лечения обширных и хронических ран за счет более раннего восстановления кожного покрова, что позволит снизить длительность системной антибактериальной терапии и необходимость назначения аутодермопластики. Это позволит повысить выживаемость пациентов в тяжёлых случаях и улучшить качество жизни (Boateng et al., 2008; Nicholas & Yeung, 2017; Oryan et al., 2017). Одним из перспективных ТБП является разработанный в Институте цитологии РАН БМКП «Эквивалент дермальный ЭД», состоящий из коллагенового геля (КГ) с заключёнными в него ФБ. Использование КЦ при разработках ТБП ограничено сложностями выращивания в условиях in vitro многослойного пласта.
Следует отметить, что применение ТБП в клинической практике сопряжено с применением различных перевязочных материалов и РП в качестве вторичного покрытия. Выбор вторичных РП является актуальной проблемой и должен основываться не только на особенностях раны, но и на биосовместимости с ТБП.
Рациональный подход заключается как в разработке различных ТБП (эквивалентов кожи), так и методик их применения в клинике. Несмотря на почти полувековую историю разработок эквивалентов кожи, к настоящему времени остается много вопросов, связанных как с требованиями к компонентам ЭК при их приготовлении, так и с технологией их применения. Отсутствие на сегодняшний день оптимальных протоколов приготовления различных эквивалентов кожи и их применения отдельно и совместно с другими раневыми покрытиями побудило нас на это исследование.
Купить

Выводы
1. Забираемые биоптаты тонкой кожи век человека представлены эпителиально-стромальным комплексом; ферментативное разделение биоптатов на эпидермис и дерму позволило выделить из эпидермиса кератиноциты, а из дермы - фибробласты и получить из них диплоидные клеточные линии. Клетки полученных линий обладают высокой пролиферативной активностью.
2. Фибробласты на всех этапах культивирования представлены клетками мезенхимо-подобного фенотипа, экспрессирующими основные стволовые и мезенхимальные маркеры, что свидетельствует об их стволовости и мезенхимальном происхождении.
3. Полученные линии фибробластов имеют нормальный кариотип 46,X; без клональных численных структурных перестроек; криоконсервация и культивирование до 15 пассажа не оказывают значимого влияния на его стабильность.
4. Кератиноциты первичной культуры представлены популяцией клеток двух фенотипов: эпителио-подобным и мезенхимо-подобным, с преобладанием первого; они характеризуются экспрессией основных стволовых и эпителиальных маркеров, что свидетельствует об их стволовости и эпителиальном происхождении. В процессе культивирования фенотип клеток сменяется на мезенхимо-подобный, что сопровождается снижением уровня экспрессии эпителиальных маркеров и появлением экспрессия N-кадгерина.
5. Индукция эпителиальной дифференцировки выявила способность кератиноцитов мезенхимо-подобного фенотипа совершать мезенхимо-эпителиальный переход и формировать многослойный эпителиальный пласт клеток, экспрессирующих характерные для многослойных эпителиев маркеры.
6. Эквиваленты кожи на основе фибробластов и кератиноцитов, культивируемых внутри коллагенового геля, характеризуются высокой жизнеспособностью клеток обеих линий. Клинические исследования последовательного применения этих эквивалентов совместно с биосовместимыми раневыми покрытиями выявили положительную динамику заживления кожных ран.
Купить