ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ФОРМИРОВАНИЯ САМООРГАНИЗУЮЩИХСЯ РЕГУЛЯРНЫХ МОНОСЛОЕВ ЛЕНГМЮРА НА ПОВЕРХНОСТИ ТВЕРДОЙ ПОДЛОЖКИ ДЛЯ АНАЛИЗА АМФИФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ МАЛДИ-МС
|
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1 МАЛДИ масс-спектрометрия 11
1.2 Механизмы образования ионов при ионизации методом МАЛДИ 13
1.2.1 Модель «ионов счастливчиков» 13
1.2.2 Модель термической ионизации 14
1.2.3 Модель комбинированной физической и химической динамики 15
1.3 Современные подходы к анализу амфифильных соединений с использованием
масс-спектрометрии 20
1.3.1 Анализ свободных жирных кислот 20
1.3.2 Анализ полипренолов 24
1.4 Монослои Ленгмюра 27
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 30
2.1 Материалы 30
2.1.1 Реактивы 30
2.1.2 Биологический материал 30
2.2 Исследование электрокинетического потенциала 31
2.3 Получение монослоев на основе монокарбоксилатов бария в чашке Петри по
технологии Ленгмюра 33
2.3 Синтез поликристаллического стеарата бария 33
2.4 Формирование пленок Ленгмюра-Блоджетт стеарата бария 34
2.5 Получение коллапсированных пленок стеариновой кислоты и ее солей в ванне
Ленгмюра 34
2.6 Измерение угла смачивания 35
2.7 Световая микроскопия 35
2.8 Спектроскопия комбинационного рассеяния 36
2.9 Инфракрасная спектроскопия 36
2.10 Сканирующая электронная микроскопия и энергодисперсионная рентгеновская
спектроскопия 37
2.11 Атомно-силовая микроскопия 37
2.12 МАЛДИ масс-спектрометрический анализ 37
2.13 Получение монослоев на основе монокарбоксилатов бария на МАЛДИ мишени . 38
2.14 Оптимизация концентрации матрицы при формировании монослоев на МАЛДИ
мишени 38
2.15 Формирование монослоев монокарбоксилатов бария на МАЛДИ мишени в
присутствии органической матрицы 39
2.16 Определение СЖК в экстрактах из биологических образцов различной природы 39
2.17 Определение СЖК методом ГХ-МС в экстрактах водорослей Fucus vesiculosus... 40
2.18 Анализ профилей СЖК в плазме крови крыс при интоксикации ацетатом ртути . 41
2.19 Определение СЖК в составе агробактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae
RCAM1026 и Sinorhizobium meliloti RCAM1021 41
2.20 Определение полипренолов методом МАЛДИ-МС с использованием технологии
Ленгмюра 42
2.21 Экстракция полипренолов из сухих листьев гинкго билоба 43
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 44
3.1 Классическая технология Ленгмюра формирования монослоев для анализа
насыщенных СЖК методом МАЛДИ-МС 44
3.2 Самоорганизация бариевой соли стеариновой кислоты на полусферической
поверхности водной субфазы 49
3.3 Анализ СЖК в виде монокарбоксилатов бария при формировании монослоев на
поверхности МАЛДИ мишени 60
3.3.1 Определение оптимальной концентрации матрицы для осуществления
эффективного МАЛДИ-МС анализа 62
3.3.2 Определение чувствительности и параметров линейности методики анализа СЖК в виде монокарбоксилатов бария при формировании монослоев на поверхности
МАЛДИ мишени 63
3.3.3 Исследование влияния изотопного распределения бария на проведение
полуколичественной оценки содержания СЖК в образце 65
3.3.4 Исследование сходимости результатов, полученных с использованием методики
анализа СЖК в виде монокарбоксилатов бария при формировании монослоев на поверхности МАЛДИ мишени 68
3.3.5 Сравнение результатов, получаемых с помощью МАЛДИ-МС и ГХ-МС 70
3.3.6 Исследование профилей СЖК в биологических образцах различной природы.. 71
3.3.7 Профилирование СЖК в плазме крови крыс при интоксикации ацетатом
ртути 82
3.3.8 Оптимизация методики анализа СЖК для проведения МАЛДИ-МС анализа в
режиме автоматической регистрации спектров 83
3.3.9 Профилирование СЖК в агробактериях Rhizobium leguminosarum bv. viciae
RCAM1026 и Sinorhizobium meliloti RCAM1021 86
3.4 Исследование механизма образования ионов при МАЛДИ-МС анализе полипренолов в виде моноалкоголятов бария 91
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 103
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 105
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ РАБОТЫ 107
БЛАГОДАРНОСТИ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
ПРИЛОЖЕНИЕ А 126
ПРИЛОЖЕНИЕ Б 128
ПРИЛОЖЕНИЕ В 142
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1 МАЛДИ масс-спектрометрия 11
1.2 Механизмы образования ионов при ионизации методом МАЛДИ 13
1.2.1 Модель «ионов счастливчиков» 13
1.2.2 Модель термической ионизации 14
1.2.3 Модель комбинированной физической и химической динамики 15
1.3 Современные подходы к анализу амфифильных соединений с использованием
масс-спектрометрии 20
1.3.1 Анализ свободных жирных кислот 20
1.3.2 Анализ полипренолов 24
1.4 Монослои Ленгмюра 27
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 30
2.1 Материалы 30
2.1.1 Реактивы 30
2.1.2 Биологический материал 30
2.2 Исследование электрокинетического потенциала 31
2.3 Получение монослоев на основе монокарбоксилатов бария в чашке Петри по
технологии Ленгмюра 33
2.3 Синтез поликристаллического стеарата бария 33
2.4 Формирование пленок Ленгмюра-Блоджетт стеарата бария 34
2.5 Получение коллапсированных пленок стеариновой кислоты и ее солей в ванне
Ленгмюра 34
2.6 Измерение угла смачивания 35
2.7 Световая микроскопия 35
2.8 Спектроскопия комбинационного рассеяния 36
2.9 Инфракрасная спектроскопия 36
2.10 Сканирующая электронная микроскопия и энергодисперсионная рентгеновская
спектроскопия 37
2.11 Атомно-силовая микроскопия 37
2.12 МАЛДИ масс-спектрометрический анализ 37
2.13 Получение монослоев на основе монокарбоксилатов бария на МАЛДИ мишени . 38
2.14 Оптимизация концентрации матрицы при формировании монослоев на МАЛДИ
мишени 38
2.15 Формирование монослоев монокарбоксилатов бария на МАЛДИ мишени в
присутствии органической матрицы 39
2.16 Определение СЖК в экстрактах из биологических образцов различной природы 39
2.17 Определение СЖК методом ГХ-МС в экстрактах водорослей Fucus vesiculosus... 40
2.18 Анализ профилей СЖК в плазме крови крыс при интоксикации ацетатом ртути . 41
2.19 Определение СЖК в составе агробактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae
RCAM1026 и Sinorhizobium meliloti RCAM1021 41
2.20 Определение полипренолов методом МАЛДИ-МС с использованием технологии
Ленгмюра 42
2.21 Экстракция полипренолов из сухих листьев гинкго билоба 43
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 44
3.1 Классическая технология Ленгмюра формирования монослоев для анализа
насыщенных СЖК методом МАЛДИ-МС 44
3.2 Самоорганизация бариевой соли стеариновой кислоты на полусферической
поверхности водной субфазы 49
3.3 Анализ СЖК в виде монокарбоксилатов бария при формировании монослоев на
поверхности МАЛДИ мишени 60
3.3.1 Определение оптимальной концентрации матрицы для осуществления
эффективного МАЛДИ-МС анализа 62
3.3.2 Определение чувствительности и параметров линейности методики анализа СЖК в виде монокарбоксилатов бария при формировании монослоев на поверхности
МАЛДИ мишени 63
3.3.3 Исследование влияния изотопного распределения бария на проведение
полуколичественной оценки содержания СЖК в образце 65
3.3.4 Исследование сходимости результатов, полученных с использованием методики
анализа СЖК в виде монокарбоксилатов бария при формировании монослоев на поверхности МАЛДИ мишени 68
3.3.5 Сравнение результатов, получаемых с помощью МАЛДИ-МС и ГХ-МС 70
3.3.6 Исследование профилей СЖК в биологических образцах различной природы.. 71
3.3.7 Профилирование СЖК в плазме крови крыс при интоксикации ацетатом
ртути 82
3.3.8 Оптимизация методики анализа СЖК для проведения МАЛДИ-МС анализа в
режиме автоматической регистрации спектров 83
3.3.9 Профилирование СЖК в агробактериях Rhizobium leguminosarum bv. viciae
RCAM1026 и Sinorhizobium meliloti RCAM1021 86
3.4 Исследование механизма образования ионов при МАЛДИ-МС анализе полипренолов в виде моноалкоголятов бария 91
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 103
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 105
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ РАБОТЫ 107
БЛАГОДАРНОСТИ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
ПРИЛОЖЕНИЕ А 126
ПРИЛОЖЕНИЕ Б 128
ПРИЛОЖЕНИЕ В 142
Масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ-МС) является хорошо зарекомендовавшим себя методом для чувствительного, высокопроизводительного и экономически эффективного определения широкого спектра аналитов, относящихся к большеразмерным молекулам и молекулярным комплексам. При этом анализ низкомолекулярных соединений затруднен, так как при классическом МАЛДИ-МС анализе в масс-спектре в диапазоне низких значений m/z (m/z < 1000) преобладают сигналы низкомолекулярных матричных ионов. Следовательно, наиболее серьезной проблемой для МАЛДИ-МС при непосредственном анализе низкомолекулярных соединений являются помехи в масс-спектре, создаваемые сигналами матрицы. Одним из подходов, позволяющих нивелировать интерференцию матричных сигналов в диапазоне низких значений m/z, является дериватизация аналитов. С одной стороны дериватизация позволяет «переместить» сигнал аналита в область более высоких масс, а с другой - избирательное введение в состав нейтральной молекулы хорошо ионизируемых групп позволяет значительно повысить чувствительность и селективность анализа. Этот подход очень актуален при определении амфифильных соединений, имеющих низкую способность к ионизации, таких как длинноцепочечные спирты и жирные карбоновые кислоты. Такой анализ востребован как для контроля качества пищевых продуктов, лекарственных средств и биологически активных добавок, так и в медицине, в том числе при диагностике заболеваний. Так было показано, что введение в состав молекулы атомов металлов, например, бария, который обладает свойствами матрицы, в ряде случаев позволяет повысить выход ионов амфифильных соединений в виде их солей при ионизации в том числе и под воздействием лазера. Зачастую, дериватизация является достаточно долгим и трудоемким процессом пробоподготовки, а реакция введения функциональной группы редко проходит полностью. В то же время, известно, что технология Ленгмюра, позволяет проводить реакцию солеобразования с образованием самоорганизующихся регулярных монослоев карбоксилатов металлов количественно. Однако при использовании такого подхода в аналитических целях потребуется специальная установка для получения монослоев, перенос монослоя в пробирку и подбор условий его растворения. И только затем становится возможным нанесение образца на мишень с целью дальнейшего МАЛДИ-МС анализа.
Следует отметить, что в последние годы все чаще предлагается формат МАЛДИ- МС анализа на основе проведения одного или нескольких этапов пробоподготовки непосредственно на поверхности МАЛДИ мишени, который получил название «лаборатория на мишени» и позволяет сократить время эксперимента, снизить затраты на реактивы и уменьшить количество требуемого образца. Проведение дериватизации амфифильных соединений на поверхности мишени при формировании самоорганизующихся монослоев Ленгмюра бариевых солей амфифильных соединений с их последующим коллапсированием и разрушением может позволить значительно повысить выход ионов при МАЛДИ-МС анализе этого класса соединений. Соответственно, поиск решения, позволяющего проводить реакцию образования солей амфифильных соединений непосредственно на МАЛДИ мишени, является весьма актуальным.
Цель и задачи работы
Целью работы являлась разработка метода формирования самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей амфифильных соединений на поверхности МАЛДИ мишени за счет адаптации технологии Ленгмюра к полусферической поверхности водной субфазы для расширения возможностей анализа амфифильных соединений методом МАЛДИ-МС.
Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
1. Выявить механизм формирования самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей свободных жирных кислот, полученных по технологии Ленгмюра на плоской поверхности водной субфазы.
2. Исследовать возможность МАЛДИ-МС анализа бариевых солей амфифильных соединений в составе монослоя, полученного на плоской поверхности водной субфазы.
3. Разработать метод формирования монослоев бариевых солей амфифильных соединений на поверхности МАЛДИ мишени при нанесении н-гексанового раствора аналита на каплю водной субфазы.
4. Исследовать механизм формирования самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей амфифильных соединений путем изучения структуры и состава пленок, сформированных на поверхности МАЛДИ мишени с использованием технологии Ленгмюра, адаптированной к полусферической поверхности водной субфазы.
5. Разработать методику МАЛДИ-МС анализа бариевых солей амфифильных соединений в монослоях, сформированных на поверхности МАЛДИ мишени, и оценить количественные характеристики методики определения свободных жирных кислот.
6. Исследовать механизм образования ионов при МАЛДИ-МС анализе монослоев бариевых солей амфифильных соединений на примере полипренолов.
7. Провести апробацию методики анализа амфифильных соединений с использованием биологических образцов различной природы.
Научная новизна
1. Разработан метод формирования монослоев бариевых солей амфифильных соединений на поверхности МАЛДИ мишени за счет адаптации технологии Ленгмюра к полусферической поверхности водной субфазы.
2. Показано, что механизмом образования самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей амфифильных соединений, полученных на поверхности МАЛДИ мишени, является самопроизвольное перемещение монослоев с полусферической поверхности водной субфазы на подложку под действием силы тяжести, где происходит образование мультимолекулярных структур, аналогичных коллапсированным монослоям.
3. Установлено, что ионизация бариевых солей амфифильных соединений происходит за счет отщепления нежирного кислотного остатка (или гидроксильной группы) под воздействием лазерного импульса с образованием иона [M-H+Ba]+.
4. Доказано, что при нанесении н-гексанового раствора полипренолов на поверхность водной субфазы, содержащей ионы бария, на границе раздела фаз образуются алкоголяты бария, которые детектируются методом МАЛДИ-МС.
5. Разработана оригинальная методика МАЛДИ-МС анализа амфифильных соединений в виде их бариевых солей в составе монослоев, формирующихся непосредственно на поверхности МАЛДИ мишени.
Практическая значимость
Предложенный метод формирования самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей амфифильных соединений непосредственно на МАЛДИ мишени позволил увеличить чувствительность анализа амфифильных соединений методом МАЛДИ-МС и сократить время пробоподготовки. Разработанная методика анализа свободных жирных кислот в виде их монокарбоксилатов бария была внедрена и используется в лаборатории молекулярной токсикологии и экспериментальной терапии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России (акт № 1/22 от 14.11.2022) и в лаборатории раннего эмбриогенеза ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» (акт № 1-22 от 24.11.2022) (Приложение А).
Полученные результаты могут быть использованы для скрининга амфифильных соединений в целях контроля качества лекарственных средств, биологически активных добавок и продуктов питания, а также в научно-исследовательских медицинских учреждениях для разработки новых методов диагностики заболеваний.
Положения, выносимые на защиту
1. Технология Ленгмюра, адаптированная к поверхности капли, позволяет при нанесении стеариновой кислоты в н-гексане на каплю водной субфазы, содержащей ионы бария, формировать на поверхности МАЛДИ мишени мультимолекулярные структуры на основе коллапсированных самоорганизующихся регулярных монослоев стеарата бария по механизму самопроизвольного перемещения монослоев с полусферической поверхности водной субфазы на подложку под действием силы тяжести.
2. Нанесение смеси свободных жирных кислот в н-гексане на каплю водной субфазы, содержащей ионы бария, приводит к формированию регулярного монослоя, состоящего из монокарбоксилатов бария, что позволяет проводить анализ свободных жирных кислот методом МАЛДИ-МС с высокой чувствительностью, точностью и воспроизводимостью.
3. Формирование структур на основе коллапсированных самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей амфифильных соединений на МАЛДИ мишени позволяет проводить анализ амфифильных соединений, неспособных образовывать твердый монослой.
4. Образование бариевых солей полипренолов происходит на границе раздела фаз при нанесении н-гексанового раствора полипренолов на поверхность водной субфазы, содержащей ионы бария.
5. Основным механизмом образования иона [M-H+Ba]+ при МАЛДИ-МС анализе ненасыщенных спиртов является отщепление нежирного кислотного остатка (или гидроксильной группы) под воздействием лазерного импульса.
Личный вклад
Экспериментальная работа, обработка и представление экспериментальных данных проводились лично автором диссертации. Автор диссертации принимал непосредственное участие в разработке аналитических методик, обсуждении полученных результатов и обосновании новых научных гипотез.
Степень достоверности и апробация работы
Достоверность полученных в ходе исследования результатов обеспечивается корректностью применяемых для решения поставленных задач подходов; проведением комплексных исследований с использованием современных физико-химических методов анализа; воспроизводимостью экспериментальных данных; использованием стандартных образцов известного состава при разработке аналитических подходов; соответствием результатов современному уровню знаний в исследуемой области науки, а также результатами практической апробации разработанных подходов и методик.
Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих международных и всероссийских конференциях: Международная научно-техническая конференция «Системы контроля окружающей среды» (Севастополь, 2018-2021 гг.); Республиканская конференция с международным участием, посвященная 110-летию со дня рождения В.А. Бандарина «Физико-химическая биология как основа современной медицины» (Минск, 2019 г.); IX съезд общества физиологов растений России «Физиология растений - основа создания растений будущего» (Казань, 2019 г.); Республиканская конференция с международным участием, посвященная 80-летию со дня рождения Т.С. Морозкиной «Физико-химическая биология как основа современной медицины» (Минск, 2020 г.); Республиканская конференция с международным участием, посвященная 75-летию со дня рождения Е.В. Барковского «Физико-химическая биология как основа современной медицины» (Минск, 2021 г.); XXII Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых имени выдающихся химиков Л.П. Кулёва и Н.М. Кижнера, посвященная 125-летию со дня основания Томского политехнического университета (Томск, 2021 г.); Конференция «Липиды 2021» (Москва, 2021 г.); XXV Международная медико-биологическая конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2022 г.).
Публикации
По результатам работы опубликованы 5 статей (среди которых 4 статьи в журналах, входящих в базы данных Web of Science или Scopus, и 1 в журналах, рекомендованных ВАК для защиты диссертаций).
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы и 3 приложений.
Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 47 рисунков и 12 таблиц. Библиографический список включает 156 источников.
Следует отметить, что в последние годы все чаще предлагается формат МАЛДИ- МС анализа на основе проведения одного или нескольких этапов пробоподготовки непосредственно на поверхности МАЛДИ мишени, который получил название «лаборатория на мишени» и позволяет сократить время эксперимента, снизить затраты на реактивы и уменьшить количество требуемого образца. Проведение дериватизации амфифильных соединений на поверхности мишени при формировании самоорганизующихся монослоев Ленгмюра бариевых солей амфифильных соединений с их последующим коллапсированием и разрушением может позволить значительно повысить выход ионов при МАЛДИ-МС анализе этого класса соединений. Соответственно, поиск решения, позволяющего проводить реакцию образования солей амфифильных соединений непосредственно на МАЛДИ мишени, является весьма актуальным.
Цель и задачи работы
Целью работы являлась разработка метода формирования самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей амфифильных соединений на поверхности МАЛДИ мишени за счет адаптации технологии Ленгмюра к полусферической поверхности водной субфазы для расширения возможностей анализа амфифильных соединений методом МАЛДИ-МС.
Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
1. Выявить механизм формирования самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей свободных жирных кислот, полученных по технологии Ленгмюра на плоской поверхности водной субфазы.
2. Исследовать возможность МАЛДИ-МС анализа бариевых солей амфифильных соединений в составе монослоя, полученного на плоской поверхности водной субфазы.
3. Разработать метод формирования монослоев бариевых солей амфифильных соединений на поверхности МАЛДИ мишени при нанесении н-гексанового раствора аналита на каплю водной субфазы.
4. Исследовать механизм формирования самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей амфифильных соединений путем изучения структуры и состава пленок, сформированных на поверхности МАЛДИ мишени с использованием технологии Ленгмюра, адаптированной к полусферической поверхности водной субфазы.
5. Разработать методику МАЛДИ-МС анализа бариевых солей амфифильных соединений в монослоях, сформированных на поверхности МАЛДИ мишени, и оценить количественные характеристики методики определения свободных жирных кислот.
6. Исследовать механизм образования ионов при МАЛДИ-МС анализе монослоев бариевых солей амфифильных соединений на примере полипренолов.
7. Провести апробацию методики анализа амфифильных соединений с использованием биологических образцов различной природы.
Научная новизна
1. Разработан метод формирования монослоев бариевых солей амфифильных соединений на поверхности МАЛДИ мишени за счет адаптации технологии Ленгмюра к полусферической поверхности водной субфазы.
2. Показано, что механизмом образования самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей амфифильных соединений, полученных на поверхности МАЛДИ мишени, является самопроизвольное перемещение монослоев с полусферической поверхности водной субфазы на подложку под действием силы тяжести, где происходит образование мультимолекулярных структур, аналогичных коллапсированным монослоям.
3. Установлено, что ионизация бариевых солей амфифильных соединений происходит за счет отщепления нежирного кислотного остатка (или гидроксильной группы) под воздействием лазерного импульса с образованием иона [M-H+Ba]+.
4. Доказано, что при нанесении н-гексанового раствора полипренолов на поверхность водной субфазы, содержащей ионы бария, на границе раздела фаз образуются алкоголяты бария, которые детектируются методом МАЛДИ-МС.
5. Разработана оригинальная методика МАЛДИ-МС анализа амфифильных соединений в виде их бариевых солей в составе монослоев, формирующихся непосредственно на поверхности МАЛДИ мишени.
Практическая значимость
Предложенный метод формирования самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей амфифильных соединений непосредственно на МАЛДИ мишени позволил увеличить чувствительность анализа амфифильных соединений методом МАЛДИ-МС и сократить время пробоподготовки. Разработанная методика анализа свободных жирных кислот в виде их монокарбоксилатов бария была внедрена и используется в лаборатории молекулярной токсикологии и экспериментальной терапии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России (акт № 1/22 от 14.11.2022) и в лаборатории раннего эмбриогенеза ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» (акт № 1-22 от 24.11.2022) (Приложение А).
Полученные результаты могут быть использованы для скрининга амфифильных соединений в целях контроля качества лекарственных средств, биологически активных добавок и продуктов питания, а также в научно-исследовательских медицинских учреждениях для разработки новых методов диагностики заболеваний.
Положения, выносимые на защиту
1. Технология Ленгмюра, адаптированная к поверхности капли, позволяет при нанесении стеариновой кислоты в н-гексане на каплю водной субфазы, содержащей ионы бария, формировать на поверхности МАЛДИ мишени мультимолекулярные структуры на основе коллапсированных самоорганизующихся регулярных монослоев стеарата бария по механизму самопроизвольного перемещения монослоев с полусферической поверхности водной субфазы на подложку под действием силы тяжести.
2. Нанесение смеси свободных жирных кислот в н-гексане на каплю водной субфазы, содержащей ионы бария, приводит к формированию регулярного монослоя, состоящего из монокарбоксилатов бария, что позволяет проводить анализ свободных жирных кислот методом МАЛДИ-МС с высокой чувствительностью, точностью и воспроизводимостью.
3. Формирование структур на основе коллапсированных самоорганизующихся регулярных монослоев бариевых солей амфифильных соединений на МАЛДИ мишени позволяет проводить анализ амфифильных соединений, неспособных образовывать твердый монослой.
4. Образование бариевых солей полипренолов происходит на границе раздела фаз при нанесении н-гексанового раствора полипренолов на поверхность водной субфазы, содержащей ионы бария.
5. Основным механизмом образования иона [M-H+Ba]+ при МАЛДИ-МС анализе ненасыщенных спиртов является отщепление нежирного кислотного остатка (или гидроксильной группы) под воздействием лазерного импульса.
Личный вклад
Экспериментальная работа, обработка и представление экспериментальных данных проводились лично автором диссертации. Автор диссертации принимал непосредственное участие в разработке аналитических методик, обсуждении полученных результатов и обосновании новых научных гипотез.
Степень достоверности и апробация работы
Достоверность полученных в ходе исследования результатов обеспечивается корректностью применяемых для решения поставленных задач подходов; проведением комплексных исследований с использованием современных физико-химических методов анализа; воспроизводимостью экспериментальных данных; использованием стандартных образцов известного состава при разработке аналитических подходов; соответствием результатов современному уровню знаний в исследуемой области науки, а также результатами практической апробации разработанных подходов и методик.
Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих международных и всероссийских конференциях: Международная научно-техническая конференция «Системы контроля окружающей среды» (Севастополь, 2018-2021 гг.); Республиканская конференция с международным участием, посвященная 110-летию со дня рождения В.А. Бандарина «Физико-химическая биология как основа современной медицины» (Минск, 2019 г.); IX съезд общества физиологов растений России «Физиология растений - основа создания растений будущего» (Казань, 2019 г.); Республиканская конференция с международным участием, посвященная 80-летию со дня рождения Т.С. Морозкиной «Физико-химическая биология как основа современной медицины» (Минск, 2020 г.); Республиканская конференция с международным участием, посвященная 75-летию со дня рождения Е.В. Барковского «Физико-химическая биология как основа современной медицины» (Минск, 2021 г.); XXII Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых имени выдающихся химиков Л.П. Кулёва и Н.М. Кижнера, посвященная 125-летию со дня основания Томского политехнического университета (Томск, 2021 г.); Конференция «Липиды 2021» (Москва, 2021 г.); XXV Международная медико-биологическая конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2022 г.).
Публикации
По результатам работы опубликованы 5 статей (среди которых 4 статьи в журналах, входящих в базы данных Web of Science или Scopus, и 1 в журналах, рекомендованных ВАК для защиты диссертаций).
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы и 3 приложений.
Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 47 рисунков и 12 таблиц. Библиографический список включает 156 источников.
1. Разработан метод формирования монослоев бариевых солей амфифильных соединений на поверхности МАЛДИ мишени за счет адаптации технологии Ленгмюра к полусферической поверхности водной субфазы для дальнейшего масс- спектрометрического анализа, позволяющий сократить время пробоподготовки и увеличить чувствительность анализа амфифильных соединений методом МАЛДИ-МС.
2. Доказано, что технология Ленгмюра, адаптированная к поверхности капли, позволяет формировать мультимолекулярные структуры на основе коллапсированных самоорганизующихся регулярных монослоев стеарата бария в пределах ячейки МАЛДИ мишени в результате самопроизвольного перемещения монослоев с полусферической поверхности водной субфазы на подложку под действием силы тяжести.
3. Продемонстрировано, что нанесение смеси свободных жирных кислот в н-гексане приводит к образованию регулярного монослоя монокарбоксилатов бария, что позволяет проводить профилирование свободных жирных кислот методом МАЛДИ-МС с высокой чувствительностью, точностью и воспроизводимостью.
4. Установлено, что при МАЛДИ-МС анализе амфифильных соединений в виде их солей бария основным механизмом образования иона [M-H+Ba]+ является отщепление нежирного кислотного остатка (или гидроксильной группы) под воздействием лазерного импульса.
5. На примере полипренолов с помощью метода МАЛДИ-МС показано, что образование солей амфифильных соединений, относящихся к неионогенным ПАВ, происходит на границе раздела фаз при нанесении н-гексанового раствора ПАВ на поверхность водной субфазы, содержащей ионы металла.
6. Определены условия проведения эффективного МАЛДИ-МС анализа амфифильных соединений в виде их солей бария. Показано, что использование в качестве водной субфазы водного раствора ацетата бария в концентрации 0,25 мг/мл, содержащего органическую матрицу, 2,5-дигидроксибензойную кислоту, в концентрации 0,25 мг/мл, позволяет проводить эффективный масс-спектрометрический анализ свободных жирных кислот и ненасыщенных спиртов в составе монослоев, сформированных на МАЛДИ мишени. Установлено, что пределы обнаружения для смеси стандартов 5 насыщенных СЖК составили от 10 до 50 фмоль, а пределы количественного определения СЖК не
104 превышали 500 фмоль. Для полипренолов предел обнаружения составил 6 пг смеси полипренолов, выделенных из пихты сибирской.
7. Показано, что разработанная методика анализа амфифильных соединений в виде их солей бария методом МАЛДИ-МС может быть успешно использована для профилирования свободных жирных кислот и полипренолов в составе биологических образцов различной природы.
2. Доказано, что технология Ленгмюра, адаптированная к поверхности капли, позволяет формировать мультимолекулярные структуры на основе коллапсированных самоорганизующихся регулярных монослоев стеарата бария в пределах ячейки МАЛДИ мишени в результате самопроизвольного перемещения монослоев с полусферической поверхности водной субфазы на подложку под действием силы тяжести.
3. Продемонстрировано, что нанесение смеси свободных жирных кислот в н-гексане приводит к образованию регулярного монослоя монокарбоксилатов бария, что позволяет проводить профилирование свободных жирных кислот методом МАЛДИ-МС с высокой чувствительностью, точностью и воспроизводимостью.
4. Установлено, что при МАЛДИ-МС анализе амфифильных соединений в виде их солей бария основным механизмом образования иона [M-H+Ba]+ является отщепление нежирного кислотного остатка (или гидроксильной группы) под воздействием лазерного импульса.
5. На примере полипренолов с помощью метода МАЛДИ-МС показано, что образование солей амфифильных соединений, относящихся к неионогенным ПАВ, происходит на границе раздела фаз при нанесении н-гексанового раствора ПАВ на поверхность водной субфазы, содержащей ионы металла.
6. Определены условия проведения эффективного МАЛДИ-МС анализа амфифильных соединений в виде их солей бария. Показано, что использование в качестве водной субфазы водного раствора ацетата бария в концентрации 0,25 мг/мл, содержащего органическую матрицу, 2,5-дигидроксибензойную кислоту, в концентрации 0,25 мг/мл, позволяет проводить эффективный масс-спектрометрический анализ свободных жирных кислот и ненасыщенных спиртов в составе монослоев, сформированных на МАЛДИ мишени. Установлено, что пределы обнаружения для смеси стандартов 5 насыщенных СЖК составили от 10 до 50 фмоль, а пределы количественного определения СЖК не
104 превышали 500 фмоль. Для полипренолов предел обнаружения составил 6 пг смеси полипренолов, выделенных из пихты сибирской.
7. Показано, что разработанная методика анализа амфифильных соединений в виде их солей бария методом МАЛДИ-МС может быть успешно использована для профилирования свободных жирных кислот и полипренолов в составе биологических образцов различной природы.