Получение рекомбинантного антимикробного пептида UBI18-35
|
Введение 16
1. Обзор литературы 19
1.1. Актуальность своевременной диагностики гнойных инфекций 19
1.2. Механизм действия антимикробных пептидов при воспалении 21
1.3. Дифференцирование воспаления и инфекции 22
1.4. Контрастные агенты и методы ядерной медицины для визуализации
бактериальных инфекций 23
1.5. Меченные противомикробные препараты для дифференциальной
диагностики инфекций 25
1.6. Твердофазный синтез антимикробных пептидов 27
1.7. Получение антимикробных пептидов с использованием
рекомбинантных технологий 30
2. Объект и методы исследования 34
2.1. Материалы 34
2.1.1. Приборы 34
2.1.2. Расходные материалы 34
2.1.3. Рабочие материалы 34
2.2. Методы 36
2.2.1. Стерилизация посуды 36
2.2.2. Приготовление сред 37
2.2.3. Индукция экспрессии пептида UBI18-35 в составе белка-слияния с
кетостероидизомеразой (KSI) 37
2.2.4. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 37
2.2.5. Вестерн-блот анализ 38
2.2.6. Определение концентрации белка методом Брэдфорда 38
2.2.7. Аффинная хроматография 39
2.2.8. Отмывка телец включения 40
2.2.9. Химическое отщепление UBI18-35 от белка-партнера с
использованием CNBr 41
2.2.10. Электрофорез низкомолекулярных белков и пептидов 41
2.2.11. Выделение пептида из смеси после отщепления от белка-партнера 42
2.2.12. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация
времяпролетная масс-спектрометрия 42
2.2.13. Твердофазный синтез антимикробного пептида UBI18-35 с
использованием Fmoc-защищенных аминокислот 43
3. Результаты и обсуждение 46
3.1. Экспрессия пептида UBI18-35 в составе белка-слияния с
кетостероидизомеразой (KSI) 46
3.2. Очистка пептида в составе белка-слияния (KSI-UBI18-35) методом
металл-аффинной хроматографии 48
3.3. Отмывка телец включения KSI-UBI18-35 50
3.4. Химическое отщепление пептида от белка-слияния 52
3.5. Выделение и анализ индивидуального рекомбинантного пептида
UBI18-35 из смеси 54
3.6. Твердофазный синтез антимикробного пептида UBI18-35 56
4. Финансовый менеджмент, ресурсоэффективность и ресурсосбережение 59
4.1. Предпроектный анализ 59
4.1.1. Потенциальные потребители результатов исследования 59
4.1.2. Сегментирование рынка 60
4.1.3. Анализ конкурентных технических решений с позиции
ресурсоэффективности и ресурсосбережения 62
4.1.4. SWOT-анализ
4.1.5. Оценка готовности проекта к коммерциализации 65
4.1.6. Методы коммерциализации результатов научно-технического
исследования 66
4.2. Инициация проекта 67
4.2.1. Цели и результат проекта 67
4.2.2. Организационная структура проекта 69
4.2.3. Ограничения и допущения проекта 69
4.3. Планирование управления научно-техническим проектом 70
4.3.1. Иерархическая структура работ проекта 70
4.3.2. Контрольные события проекта 71
4.3.3. План проекта 72
4.4. Бюджет научного исследования 74
4.4.1. Сырье, материалы, покупные изделия и полуфабрикаты (за
вычетом отходов) 74
4.4.2. Специальное оборудование для научных (экспериментальных)
работ 75
4.4.3. Основная заработная плата исполнителей темы 76
4.4.4. Дополнительная заработная плата исполнителей темы 79
4.4.5. Отчисления во внебюджетные фонды (страховые отчисления) 79
4.4.6. Контрагентные расходы 80
4.4.7. Накладные расходы 80
4.4.8. Формирование бюджета затрат научно-исследовательского проекта 81
4.5. Организационная структура проекта 82
4.6. Матрица ответственности 83
4.7. План управления коммуникациями проекта 84
4.8. Реестр рисков проекта
4.9. Определение ресурсной (ресурсосберегающей), финансовой, бюджетной, социальной и экономической эффективности исследования.. 85
4.9.1. Оценка сравнительной эффективности исследования 85
Список публикаций студента 101
Список использованных источников 103
1. Обзор литературы 19
1.1. Актуальность своевременной диагностики гнойных инфекций 19
1.2. Механизм действия антимикробных пептидов при воспалении 21
1.3. Дифференцирование воспаления и инфекции 22
1.4. Контрастные агенты и методы ядерной медицины для визуализации
бактериальных инфекций 23
1.5. Меченные противомикробные препараты для дифференциальной
диагностики инфекций 25
1.6. Твердофазный синтез антимикробных пептидов 27
1.7. Получение антимикробных пептидов с использованием
рекомбинантных технологий 30
2. Объект и методы исследования 34
2.1. Материалы 34
2.1.1. Приборы 34
2.1.2. Расходные материалы 34
2.1.3. Рабочие материалы 34
2.2. Методы 36
2.2.1. Стерилизация посуды 36
2.2.2. Приготовление сред 37
2.2.3. Индукция экспрессии пептида UBI18-35 в составе белка-слияния с
кетостероидизомеразой (KSI) 37
2.2.4. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 37
2.2.5. Вестерн-блот анализ 38
2.2.6. Определение концентрации белка методом Брэдфорда 38
2.2.7. Аффинная хроматография 39
2.2.8. Отмывка телец включения 40
2.2.9. Химическое отщепление UBI18-35 от белка-партнера с
использованием CNBr 41
2.2.10. Электрофорез низкомолекулярных белков и пептидов 41
2.2.11. Выделение пептида из смеси после отщепления от белка-партнера 42
2.2.12. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация
времяпролетная масс-спектрометрия 42
2.2.13. Твердофазный синтез антимикробного пептида UBI18-35 с
использованием Fmoc-защищенных аминокислот 43
3. Результаты и обсуждение 46
3.1. Экспрессия пептида UBI18-35 в составе белка-слияния с
кетостероидизомеразой (KSI) 46
3.2. Очистка пептида в составе белка-слияния (KSI-UBI18-35) методом
металл-аффинной хроматографии 48
3.3. Отмывка телец включения KSI-UBI18-35 50
3.4. Химическое отщепление пептида от белка-слияния 52
3.5. Выделение и анализ индивидуального рекомбинантного пептида
UBI18-35 из смеси 54
3.6. Твердофазный синтез антимикробного пептида UBI18-35 56
4. Финансовый менеджмент, ресурсоэффективность и ресурсосбережение 59
4.1. Предпроектный анализ 59
4.1.1. Потенциальные потребители результатов исследования 59
4.1.2. Сегментирование рынка 60
4.1.3. Анализ конкурентных технических решений с позиции
ресурсоэффективности и ресурсосбережения 62
4.1.4. SWOT-анализ
4.1.5. Оценка готовности проекта к коммерциализации 65
4.1.6. Методы коммерциализации результатов научно-технического
исследования 66
4.2. Инициация проекта 67
4.2.1. Цели и результат проекта 67
4.2.2. Организационная структура проекта 69
4.2.3. Ограничения и допущения проекта 69
4.3. Планирование управления научно-техническим проектом 70
4.3.1. Иерархическая структура работ проекта 70
4.3.2. Контрольные события проекта 71
4.3.3. План проекта 72
4.4. Бюджет научного исследования 74
4.4.1. Сырье, материалы, покупные изделия и полуфабрикаты (за
вычетом отходов) 74
4.4.2. Специальное оборудование для научных (экспериментальных)
работ 75
4.4.3. Основная заработная плата исполнителей темы 76
4.4.4. Дополнительная заработная плата исполнителей темы 79
4.4.5. Отчисления во внебюджетные фонды (страховые отчисления) 79
4.4.6. Контрагентные расходы 80
4.4.7. Накладные расходы 80
4.4.8. Формирование бюджета затрат научно-исследовательского проекта 81
4.5. Организационная структура проекта 82
4.6. Матрица ответственности 83
4.7. План управления коммуникациями проекта 84
4.8. Реестр рисков проекта
4.9. Определение ресурсной (ресурсосберегающей), финансовой, бюджетной, социальной и экономической эффективности исследования.. 85
4.9.1. Оценка сравнительной эффективности исследования 85
Список публикаций студента 101
Список использованных источников 103
На сегодняшний день перед практикующими врачами остро стоит проблема дифференциальной диагностики асептического и бактериального воспаления. Это обусловлено в первую очередь тем, что своевременное разграничение септического и асептического воспалений играет решающую роль для определения дальнейшей тактики лечения и позволяет избежать развития тяжелых осложнений. Эффективным решением проблемы дифференциальной диагностики инфекционного воспаления является использование сцинтиграфии с радиоактивно-мечеными антимикробными пептидами [1]. В настоящее время короткие пептиды широко используются в диагностических целях. Они обеспечивают высокоспецифичное связывание с клетками-мишенями, но имеют меньшие размеры по сравнению с белками и низкую иммуногенность [2]. Так, предложен высокоэффективный подход к дифференциальной диагностике микробного воспаления на основе антимикробного пептида UBI18-35. Благодаря способности пептида встраиваться в мембрану микробной клетки, достигается высокоселективное накопление его в очаге гнойного воспаления, тогда как накопления в стерильных участках воспаления не происходит [3].
В настоящее время антимикробные пептиды преимущественно получают методом химического синтеза. Данный метод рационален на этапе выбора пептида с оптимальными характеристиками, поиска пептида с высокой специфичностью к определенной мишени (патологической клетке, инфекционному агенту, очагу развития патологического процесса), в процессе которого может потребоваться перебор различных аминокислотных последовательностей. Однако получение необходимого количества пептида, особенно гидрофобного и/или с длинной последовательности более 15 а.к.о., методом твердофазного синтеза имеется ряд недостатков [4], а именно: возникновение ошибочных последовательностей, пропуск аминокислот из-за неполноты протекания стадий деблокирования и аминообразования;
самоассоциация пептидных цепей за счет формирования водородных связей, вызывающая экранирование N-концевой аминогруппы; а также высокая стоимость синтеза. Дополнительным негативным фактором химического синтеза является применение в работе токсичных растворителей и реагентов. Таким образом, получение пептида в достаточных количествах для клинического применения методом твердофазного синтеза является высоко затратным.
Выгодной альтернативой является получение пептидов с использованием технологии рекомбинантных ДНК методом микробного синтеза. Для реализации данного подхода необходимо получить рекомбинатный штамм-продуцент и оптимизировать условия выделения пептида. При этом необходимо исключить риски протеолитической деградации пептида внутри клетки, а также его потенциальный негативный эффект на клетку-хозяина. Наиболее эффективным подходом является интеграция целевого пептида с белком-партнером.
Объектом исследования является рекомбинантная технология получения антимикробных пептидов.
Цель работы: получить очищенный препарат антимикробного пептида UBI18-35.
Задачи:
1. Подобрать условия эффективной экспрессии пептида в составе белка-слияния с кетостероидизомеразой;
2. Оптимизировать методы выделения и хроматографической очистки химерного белка;
3. Отделить пептид от белка-слияния за счет обработки бромцианом
4. Получить препарат пептида высокой чистоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ;
5. Подтвердить структуру полученного пептида методом масс- спектрометрии.
Апробация работы:
«Дизайн экспрессионной конструкции для получения антимикробного пептида UBI18-35 в бактериальной системе» участие и публикация тезисов во Всероссийской 73 итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова, Томск, 1-3 Апреля 2014.
«E. Coli Strains for Recombinant UBI18-35 and Phlip Peptides Production» участие и публикация тезисов в IV международной научно-практической конференции, Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине, Казань, 29 Октября-1 Ноября, 2014.
«Экспрессия рекомбинантного пептида UBI18-35 в бактериальной системе», публикация тезисов в сборнике XXVII Зимней молодёжной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 9-12 февраля 2015.
«Получение антимикробного пептида UBI18-35 с использованием рекомбинантных технологий», участие и публикация тезисов в Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспективы развития фундаментальных наук», Томск, 21-24 апреля, 2015.
«Получение рекомбинантных пептидов UBI18-35 и pHLIP для диагностики», участие и публикация тезисов во Второй Международной биотехнологической школе «Рекомбинантные антитела и вакцины», Барнаул, 14-19 сентября, 2015.
«Дизайн векторной конструкции для экспрессии антимикробного пептида UBI18-35 в бактериальной системе» участие в Конкурсе научноисследовательских работ студентов и аспирантов ВУЗов и научно - академических институтов России по естественным, техническим и гуманитарным наукам «Шаг в науку», Томск, с 20 июня по 20 ноября 2015.
«Recombinant production of antimicrobial peptide UBI18-35 for diagnostics of inflammations», Диплом II степени, публикация тезисов во Всероссийской итоговой 75 студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова, Томск, 25-27 апреля, 2016.
«Получение рекомбинантного антимикробного пептида UBI18-35 для дифференциальной диагностики воспалений», Диплом II степени, публикация тезисов в XV Всероссийской научно-практической конференции «Химия и химическая технология в XXI веке», Томск, 17-20 мая, 2016.
В настоящее время антимикробные пептиды преимущественно получают методом химического синтеза. Данный метод рационален на этапе выбора пептида с оптимальными характеристиками, поиска пептида с высокой специфичностью к определенной мишени (патологической клетке, инфекционному агенту, очагу развития патологического процесса), в процессе которого может потребоваться перебор различных аминокислотных последовательностей. Однако получение необходимого количества пептида, особенно гидрофобного и/или с длинной последовательности более 15 а.к.о., методом твердофазного синтеза имеется ряд недостатков [4], а именно: возникновение ошибочных последовательностей, пропуск аминокислот из-за неполноты протекания стадий деблокирования и аминообразования;
самоассоциация пептидных цепей за счет формирования водородных связей, вызывающая экранирование N-концевой аминогруппы; а также высокая стоимость синтеза. Дополнительным негативным фактором химического синтеза является применение в работе токсичных растворителей и реагентов. Таким образом, получение пептида в достаточных количествах для клинического применения методом твердофазного синтеза является высоко затратным.
Выгодной альтернативой является получение пептидов с использованием технологии рекомбинантных ДНК методом микробного синтеза. Для реализации данного подхода необходимо получить рекомбинатный штамм-продуцент и оптимизировать условия выделения пептида. При этом необходимо исключить риски протеолитической деградации пептида внутри клетки, а также его потенциальный негативный эффект на клетку-хозяина. Наиболее эффективным подходом является интеграция целевого пептида с белком-партнером.
Объектом исследования является рекомбинантная технология получения антимикробных пептидов.
Цель работы: получить очищенный препарат антимикробного пептида UBI18-35.
Задачи:
1. Подобрать условия эффективной экспрессии пептида в составе белка-слияния с кетостероидизомеразой;
2. Оптимизировать методы выделения и хроматографической очистки химерного белка;
3. Отделить пептид от белка-слияния за счет обработки бромцианом
4. Получить препарат пептида высокой чистоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ;
5. Подтвердить структуру полученного пептида методом масс- спектрометрии.
Апробация работы:
«Дизайн экспрессионной конструкции для получения антимикробного пептида UBI18-35 в бактериальной системе» участие и публикация тезисов во Всероссийской 73 итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова, Томск, 1-3 Апреля 2014.
«E. Coli Strains for Recombinant UBI18-35 and Phlip Peptides Production» участие и публикация тезисов в IV международной научно-практической конференции, Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине, Казань, 29 Октября-1 Ноября, 2014.
«Экспрессия рекомбинантного пептида UBI18-35 в бактериальной системе», публикация тезисов в сборнике XXVII Зимней молодёжной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 9-12 февраля 2015.
«Получение антимикробного пептида UBI18-35 с использованием рекомбинантных технологий», участие и публикация тезисов в Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспективы развития фундаментальных наук», Томск, 21-24 апреля, 2015.
«Получение рекомбинантных пептидов UBI18-35 и pHLIP для диагностики», участие и публикация тезисов во Второй Международной биотехнологической школе «Рекомбинантные антитела и вакцины», Барнаул, 14-19 сентября, 2015.
«Дизайн векторной конструкции для экспрессии антимикробного пептида UBI18-35 в бактериальной системе» участие в Конкурсе научноисследовательских работ студентов и аспирантов ВУЗов и научно - академических институтов России по естественным, техническим и гуманитарным наукам «Шаг в науку», Томск, с 20 июня по 20 ноября 2015.
«Recombinant production of antimicrobial peptide UBI18-35 for diagnostics of inflammations», Диплом II степени, публикация тезисов во Всероссийской итоговой 75 студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова, Томск, 25-27 апреля, 2016.
«Получение рекомбинантного антимикробного пептида UBI18-35 для дифференциальной диагностики воспалений», Диплом II степени, публикация тезисов в XV Всероссийской научно-практической конференции «Химия и химическая технология в XXI веке», Томск, 17-20 мая, 2016.