Тема: Получение рекомбинантного антимикробного пептида UBI18-35

На сегодняшний день перед практикующими врачами остро стоит проблема дифференциальной диагностики асептического и бактериального воспаления. Это обусловлено в первую очередь тем, что своевременное разграничение септического и асептического воспалений играет решающую роль для определения дальнейшей тактики лечения и позволяет избежать развития тяжелых осложнений. Эффективным решением проблемы дифференциальной диагностики инфекционного воспаления является использование сцинтиграфии с радиоактивно-мечеными антимикробными пептидами [1]. В настоящее время короткие пептиды широко используются в диагностических целях. Они обеспечивают высокоспецифичное связывание с клетками-мишенями, но имеют меньшие размеры по сравнению с белками и низкую иммуногенность [2]. Так, предложен высокоэффективный подход к дифференциальной диагностике микробного воспаления на основе антимикробного пептида UBI18-35. Благодаря способности пептида встраиваться в мембрану микробной клетки, достигается высокоселективное накопление его в очаге гнойного воспаления, тогда как накопления в стерильных участках воспаления не происходит [3].
В настоящее время антимикробные пептиды преимущественно получают методом химического синтеза. Данный метод рационален на этапе выбора пептида с оптимальными характеристиками, поиска пептида с высокой специфичностью к определенной мишени (патологической клетке, инфекционному агенту, очагу развития патологического процесса), в процессе которого может потребоваться перебор различных аминокислотных последовательностей. Однако получение необходимого количества пептида, особенно гидрофобного и/или с длинной последовательности более 15 а.к.о., методом твердофазного синтеза имеется ряд недостатков [4], а именно: возникновение ошибочных последовательностей, пропуск аминокислот из-за неполноты протекания стадий деблокирования и аминообразования;
самоассоциация пептидных цепей за счет формирования водородных связей, вызывающая экранирование N-концевой аминогруппы; а также высокая стоимость синтеза. Дополнительным негативным фактором химического синтеза является применение в работе токсичных растворителей и реагентов. Таким образом, получение пептида в достаточных количествах для клинического применения методом твердофазного синтеза является высоко затратным.
Выгодной альтернативой является получение пептидов с использованием технологии рекомбинантных ДНК методом микробного синтеза. Для реализации данного подхода необходимо получить рекомбинатный штамм-продуцент и оптимизировать условия выделения пептида. При этом необходимо исключить риски протеолитической деградации пептида внутри клетки, а также его потенциальный негативный эффект на клетку-хозяина. Наиболее эффективным подходом является интеграция целевого пептида с белком-партнером.
Объектом исследования является рекомбинантная технология получения антимикробных пептидов.
Цель работы: получить очищенный препарат антимикробного пептида UBI18-35.
Задачи:
1. Подобрать условия эффективной экспрессии пептида в составе белка-слияния с кетостероидизомеразой;
2. Оптимизировать методы выделения и хроматографической очистки химерного белка;
3. Отделить пептид от белка-слияния за счет обработки бромцианом
4. Получить препарат пептида высокой чистоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ;
5. Подтвердить структуру полученного пептида методом масс- спектрометрии.
Апробация работы:
«Дизайн экспрессионной конструкции для получения антимикробного пептида UBI18-35 в бактериальной системе» участие и публикация тезисов во Всероссийской 73 итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова, Томск, 1-3 Апреля 2014.
«E. Coli Strains for Recombinant UBI18-35 and Phlip Peptides Production» участие и публикация тезисов в IV международной научно-практической конференции, Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине, Казань, 29 Октября-1 Ноября, 2014.
«Экспрессия рекомбинантного пептида UBI18-35 в бактериальной системе», публикация тезисов в сборнике XXVII Зимней молодёжной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 9-12 февраля 2015.
«Получение антимикробного пептида UBI18-35 с использованием рекомбинантных технологий», участие и публикация тезисов в Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспективы развития фундаментальных наук», Томск, 21-24 апреля, 2015.
«Получение рекомбинантных пептидов UBI18-35 и pHLIP для диагностики», участие и публикация тезисов во Второй Международной биотехнологической школе «Рекомбинантные антитела и вакцины», Барнаул, 14-19 сентября, 2015.
«Дизайн векторной конструкции для экспрессии антимикробного пептида UBI18-35 в бактериальной системе» участие в Конкурсе научноисследовательских работ студентов и аспирантов ВУЗов и научно - академических институтов России по естественным, техническим и гуманитарным наукам «Шаг в науку», Томск, с 20 июня по 20 ноября 2015.
«Recombinant production of antimicrobial peptide UBI18-35 for diagnostics of inflammations», Диплом II степени, публикация тезисов во Всероссийской итоговой 75 студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова, Томск, 25-27 апреля, 2016.
«Получение рекомбинантного антимикробного пептида UBI18-35 для дифференциальной диагностики воспалений», Диплом II степени, публикация тезисов в XV Всероссийской научно-практической конференции «Химия и химическая технология в XXI веке», Томск, 17-20 мая, 2016.
Купить