СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Понятие об иммунитете. Противоинфекционные системы защиты живых организмов 8
1.2. Врожденный иммунитет 9
1.3. Приобретенный иммунитет 10
1.4 Антимикробные пептиды и их роль в иммунной системе организма 11
1.5. Классификация антимикробных пептидов 12
1.5.1. Классификация АМП по структуре 12
1.5.2. Представители природных Р-шпилечных антимикробных пептидов, использованных в качестве объектов исследования 13
1.5.3. Классификация АМП по источнику выделения 14
1.6. Антимикробные пептиды млекопитающих 15
1.6.1. Дефенсины 15
1.6.2. Кателицидины 16
1.7. Механизмы антимикробного действия АМП, связанные с повреждением бактериальных мембран 17
1.7.1. Категории АМП в зависимости от мишени действия 18
1.7.2. Три основные модели мембранолитического действия Р-шпилечных АМП 19
1.8. Особенности антимикробных пептидов в зависимости от наличия определенных аминокислотных остатков 20
1.8.1. Цистеин (Cys, C) и дисульфидные связи 20
1.8.2. Лизин (Lys, K) и аргинин (Arg, R) 21
1.8.3. Пролин (Pro, P) 23
1.9. Перспективы использования антимикробных пептидов в качестве лекарственных веществ нового поколения 24
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 26
2.1. Характеристика исследуемых пептидов 26
2.2. Метод серийных разведений в жидкой питательной среде 27
2.3. Метод оценки цитотоксического действия в отношении клеток человека (Гемолитический тест) 28
2.4. Фотометрический метод оценки влияния пептидов на проницаемость мембран E.coliML-35p с использованием хромогенных маркеров 29
2.5. Определение концентрации пептидов 33
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 34
3.1. Природные антимикробные пептиды, имеющие конформацию бета-шпильки 34
3.1.1. Оценка антимикробной активности исследуемых природных антимикробных пептидов 34
3.1.2. Оценка влияния исследуемых природных антимикробных пептидов на проницаемость мембран E.coli ML35p с использованием двух хромогенных маркеров: ONPG и нитроцефина 36
3.1.3. Анализ гемолитической активности исследуемых природных антимикробных пептидов в отношении эритроцитов человека 42
3.2. Синтетические аналоги природного Р-шпилечного пептида протегрина-1 (АП) 44
3.2.1. Оценка антимикробной активности исследуемых синтетических аналогов пептида протегрина-1 44
3.2.2. Оценка влияния исследуемых синтетических аналогов пептида протегрина-1 на проницаемость мембран E.coli ML35p с использованием двух хромогенных маркеров: ONPG и нитроцефина 47
3.2.3. Анализ гемолитической активности исследуемых синтетических аналогов пептида протегрина-1 в отношении эритроцитов человека 53
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 55
ВЫВОДЫ 56
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 57
По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), во всем мире более 700 000 смертей в год происходят из-за болезней, вызванных патогенными микроорганизмами, которые способны к развитию резистентности в отношении применяемых в медицине антимикробных лекарственных средств. По прогнозам, к 2050 году это число возрастёт до 10 миллионов смертей, если ничего не будет сделано для изменения текущей ситуации. Поэтому потребность в альтернативных антибактериальных препаратах необходима как никогда[1].
Одной из перспективных альтернатив являются антимикробные пептиды (ЛМП), обнаруженные почти во всех живых организмах. АМП проявляют широкий спектр антибактериальной активности и могут оказывать модулирующее действие на иммунную систему. Кроме того, выработка резистентности к ним бактерий затруднена, что делает эти соединения привлекательным объектом для разработки на их основе новых лекарств для терапии инфекций, которые вызываются бактериями с множественной лекарственной устойчивостью. Несмотря на это, терапевтическое применение ЛМП затруднено, поскольку они в большей или меньшей степени токсичны для клеток млекопитающих, многие пептиды теряют активность в физиологических условиях и подвержены протеолитической деградации. Поэтому в последнее время большинство исследований были сосредоточены на устранении этих ограничений путем модификации природных последовательностей АМП.
Такие физико-химические и биологические характеристики антимикробных пептидов, как происхождение, размер молекулы, первичная структура, тип биологической активности, механизм действия и т.д., могут быть использованы для классификации ЛМП. Однако пространственная структура пептидов оказалась наиболее удобным критерием для такой классификации. Первая классификация, основанная на пространственной структуре, была предложена в 1995 году [1]. Наличие и количество дисульфидных связей в молекуле пептида играют центральную роль в этой системе. Наиболее распространенная классификация делит все ЛМП на пять структурных классов. К первому классу относятся пептиды, имеющие линейную а-спиральную конформацию. Второй класс объединяет пептиды, содержащие Р-тяжи, которые стабилизированы дисульфидными связями. Третий класс включает пептиды, содержащие как а-спиральные, так и Р-складчатые участки. К четвёртому классу относятся циклические или образующие петли пептиды. Последний пятый класс объединяет линейные пептиды, не имеющие упорядоченной структуры, обогащённые определённой аминокислотой: пролином, триптофаном, гистидином, аргинином, глицином или их комбинациями[2].
Данная работа посвящена Р-шпилечным антимикробным пептидам, стабилизированным дисульфидными связями.
Р-шпилечные антимикробные пептиды объединяет между собой ряд важных структурно-функциональных особенностей: небольшой размер (до 25 аминокислотных остатков); суммарный положительный заряд, высокая активность и способность к быстрому уничтожению клеток-мишеней благодаря бактерицидному действию; амфифильные свойства, достаточные для проявления мембранолитической активности по отношению к широкому спектру микроорганизмов; быстрое повреждение мембраны бактерий с образованием пор, и главной особенностью является стабилизированная дисульфидными связями компактная структура, которая определяет повышенную устойчивость к действию протеаз. По сравнению со многими другими АМП Р-шпилечные антимикробные пептиды более стабильны в биологических жидкостях, в том числе плазме крови, что обусловливает интерес к этой группе пептидов у исследователей, занимающихся дизайном новых антибиотиков. Однако, несмотря на все перечисленные выше преимущества Р-шпилечных антимикробных пептидов, многие проявляют некоторую токсичность для клеток человека. Поэтому предпринимаются попытки создания структурных модификаций бета-шпилечных АМП, лишенных этих недостатков[3], для чего исследователи проводят масштабный структурно-функциональный анализ, стремясь найти оптимальную структуру пептида, которая обеспечит максимальную активность против резистентных бактерий при минимальной токсичности. Выбор наиболее перспективного природного Р -шпилечного пептида, который и станет объектом для разработки на его основе новых синтетических пептидов с улучшенными свойствами, также является важной задачей. Поэтому сравнительный анализ свойств различных природных пептидов, обладающих конформацией Р-шпильки, представляет несомненный интерес.
Одним из таких эффективных подходов к модификации Р-шпилечных пептидов является изменение длины аминокислотной последовательности, что снижает возможную иммуногенность АМП, а в некоторых случаях уменьшает цитотоксические свойства, а кроме того, определяет менее затратный химический синтез этих молекул. Другой подход - создание обширных библиотек пептидов для отбора молекул, обладающих желаемыми свойствами. Такие разработки проводятся в Институте биоорганической химии РАН им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. В нашей работе исследован ряд пептидов, полученных в результате скрининга большого числа структурных аналогов протегрина-1, имеющих различные замены аминокислотных остатков, в научной группе к.х.н. С.С. Терехова (Лаб. антибиотикорезистентности ИБХ РАН им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова).
Целью работы явилось проведение сравнительного анализа антимикробной и гемолитической активности синтетических аналогов природных в -шпилечных пептидов (Ar-1- ареницина-1; PG-1- протегрина-1; Shu-4- шучина-4 и Tan- танатина) и структурных модификаций протегрина-1 (PG sh- укороченного аналога протегрина- 1; и пептидов АП 7; АП 10; АП 75; АП- 1; АП- 2b; АП- 6)
Для достижения этой цели были поставлены определённые задачи:
1) Исследовать антибактериальную активность синтетических аналогов в-шпилечных АМП в отношении грамотрицательных (Escherichia coli ML- 35 p; Acinetobacter baumannii 7226/16; Pseudomonas aeruginosa MDR 522/17) и грамположительной бактерии (Staphylococcus aureus 1399/17)
2) Изучить эффекты синтетических аналогов в-шпилечных АМП на проницаемость наружной и внутренней мембран E.coliML-35p для хромогенных маркеров.
3) Оценить гемолитическую активность синтетических аналогов в-шпилечных АМП в отношении эритроцитов человека.
Для проведения исследований нами выбрана группа пептидов, обладающих конформацией Р-шпильки, так как эти соединения представляют интерес, как с точки зрения фундаментальных, так и прикладных исследований. Фундаментальная значимость исследования связана с тем, что данные пептиды встречаются в защитных клетках разных видов животных, играя важную роль в реализации противоинфекционной защиты. Изучение структурно-функциональных свойств пептидов данной группы вносит вклад в развитие представлений о молекулярных механизмах функционирования эффекторных звеньев системы врожденного иммунитета. Прикладное значение работы состоит в том, что данное исследование указывает на пути получения новых эффективных антибиотических средств.
Охарактеризовав биологическую активность ряда Р-шпилечных пептидов - танатина, ареницина 1, шучина 4, протегрина 1, мы пришли к выводу, что протегрин 1 представляет собой наиболее привлекательный объект исследования благодаря своей уникальной антимикробной активности, но и наиболее сложный объект вследствие низкой избирательности по отношению к бактериальным клеткам. Возможность найти пути преодоления данной проблемы низкой избирательности пептида появилась благодаря совместной работе с коллегами из Института биоорганической химии РАН им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, которые провели первичный скрининг множества структурных модификаций PG1 и отобрали наиболее перспективные. Нами получены данные, позволяющие выбрать новые структуры для дальнейшей работы по продолжению структурно-функционального анализа и создания пептидов с оптимальными свойствами (детальное обсуждение особенностей структур пептидов не представляется возможным, так как эти структуры в настоящий момент являются предметом для патентования). На данном этапе мы можем заключить, что сохранение высокого положительного заряда важно для получения активного пептида-производного PG1, а также, что замена остатков аргинина лизином в молекуле пептида, в определенных положениях может привести к изменению характера его взаимодействия с эукариотическими клетками. В дальнейшей работе планируется более детальное исследование механизмов антимикробного действия данных пептидов, сравнительный анализ новых структурных модификаций протегрина 1, расширение спектра исследуемых микроорганизмов и эукариотических клеток.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
