Помощь студентам в учебе
РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ ИММУНОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI И STAPHYLOCOCCUS AUREUS С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОЧАСТИЦ Fe3O4 В КАЧЕСТВЕ ПРЯМОЙ СИГНАЛООБРАЗУЮЩЕЙ МЕТКИ
|
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 14
1.1. Ферментные сенсоры 17
1.2. ДНК-сенсоры 22
1.3. Сенсоры на основе надмолекулярных структур клетки 26
1.4. Иммуносенсоры 29
1.4.1. Безметочные иммуносенсоры 35
1.4.2. Метка в иммуносенсорах 40
1.4.3. Электрохимические иммуносенсоры с использованием
наноматериалов для определения бактериальных агентов 48
1.5. Постановка задачи 57
ГЛАВА 2. АППАРАТУРА И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА 59
2.1. Оборудование и средства измерений 59
2.2. Реактивы и рабочие растворы 60
2.3. Методики проведения экспериментов 61
2.3.1. Синтез наночастиц Бс3О4 61
2.3.2. Модифицирование поверхности наночастиц Бс3О4 хитозаном 61
2.3.3. Модифицирование поверхности наночастиц Бс3О4 3-
аминопропилтриэтоксисиланом 62
2.3.4. Культивирование бактерий 62
2.3.5. Проведение микроскопических исследований 62
2.3.6. ИК-спектроскопия наночастиц магнетита, модифицированных
хитозаном и 3-аминопропилтриэтоксисиланом 63
2.3.7. Фотометрическое определение продуктов электропревращений
наночастиц магнетита в апротонной среде 64
2.3.8. Проведение электрохимических исследований 64
2.3.9. Подготовка поверхности планарного платинового электрода 65
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ХАРАКТЕРА ЭЛЕКТРОПРЕВРАЩЕНИЙ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА В АПРОТОННЫХ СРЕДАХ 66
3.1. Определение состава, размера и морфологии наночастиц Fe3O4 66
3.2. Получение прямого электрохимического отклика от наночастиц магнетита в
апротонной среде 69
3.3. Определение возможных механизмов электропревращений наночастиц Fe3O4
в апротонной среде 71
3.4. Исследование влияния модифицирующего покрытия на динамику
агрегирования и характер электропревращений наночастиц Fe3O4 75
3.5. Выбор оптимальных условий формирования аналитического сигнала от
наночастиц магнетита 78
ГЛАВА 4. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ИММУНОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА 88
4.1. Исследование процессов взаимодействия наночастиц магнетита с бактериальными клетками 88
4.3. Получение прямого электрохимического отклика от наночастиц магнетита,
включенных в иммунокомплекс на поверхности рабочего электрода 95
4.4. Выбор оптимальных условий формирования меченного наночастицами
магнетита иммунокомплекса на поверхности планарного платинового электрода 98
4.5. Анализ содержания бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus
aureus B-1266 в модельных суспензиях и реальных пробах 107
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 113
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ 148
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 - АКТ ИСПЫТАНИЙ 149
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 14
1.1. Ферментные сенсоры 17
1.2. ДНК-сенсоры 22
1.3. Сенсоры на основе надмолекулярных структур клетки 26
1.4. Иммуносенсоры 29
1.4.1. Безметочные иммуносенсоры 35
1.4.2. Метка в иммуносенсорах 40
1.4.3. Электрохимические иммуносенсоры с использованием
наноматериалов для определения бактериальных агентов 48
1.5. Постановка задачи 57
ГЛАВА 2. АППАРАТУРА И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА 59
2.1. Оборудование и средства измерений 59
2.2. Реактивы и рабочие растворы 60
2.3. Методики проведения экспериментов 61
2.3.1. Синтез наночастиц Бс3О4 61
2.3.2. Модифицирование поверхности наночастиц Бс3О4 хитозаном 61
2.3.3. Модифицирование поверхности наночастиц Бс3О4 3-
аминопропилтриэтоксисиланом 62
2.3.4. Культивирование бактерий 62
2.3.5. Проведение микроскопических исследований 62
2.3.6. ИК-спектроскопия наночастиц магнетита, модифицированных
хитозаном и 3-аминопропилтриэтоксисиланом 63
2.3.7. Фотометрическое определение продуктов электропревращений
наночастиц магнетита в апротонной среде 64
2.3.8. Проведение электрохимических исследований 64
2.3.9. Подготовка поверхности планарного платинового электрода 65
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ХАРАКТЕРА ЭЛЕКТРОПРЕВРАЩЕНИЙ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА В АПРОТОННЫХ СРЕДАХ 66
3.1. Определение состава, размера и морфологии наночастиц Fe3O4 66
3.2. Получение прямого электрохимического отклика от наночастиц магнетита в
апротонной среде 69
3.3. Определение возможных механизмов электропревращений наночастиц Fe3O4
в апротонной среде 71
3.4. Исследование влияния модифицирующего покрытия на динамику
агрегирования и характер электропревращений наночастиц Fe3O4 75
3.5. Выбор оптимальных условий формирования аналитического сигнала от
наночастиц магнетита 78
ГЛАВА 4. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ИММУНОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА 88
4.1. Исследование процессов взаимодействия наночастиц магнетита с бактериальными клетками 88
4.3. Получение прямого электрохимического отклика от наночастиц магнетита,
включенных в иммунокомплекс на поверхности рабочего электрода 95
4.4. Выбор оптимальных условий формирования меченного наночастицами
магнетита иммунокомплекса на поверхности планарного платинового электрода 98
4.5. Анализ содержания бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus
aureus B-1266 в модельных суспензиях и реальных пробах 107
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 113
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ 148
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 - АКТ ИСПЫТАНИЙ 149
Актуальность темы исследований
В настоящее время в связи с повсеместным загрязнением объектов окружающей среды, ослаблением производственного контроля качества питьевой воды и продуктов питания, а также снижением иммунитета у населения, имеет место стремительное распространение возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной этиологии. Наиболее распространенным возбудителем инфекционных заболеваний бактериальной этиологии являются бактерии группы кишечной палочки Escherichia coli.Являясь грамотрицательным патогеном, бактерии E. coliв норме населяют нижнюю часть кишечника теплокровных животных и человека. Однако, некоторые штаммы E. coliспособны вызывать самые различные заболевания, включая тяжелые пищевые отравления, перитонит, кольпит и сепсис. Грамположительные бактерии Staphylococcus aureusотносятся к возбудителям множества кожных и инфекционно-токсических заболеваний. Ключевыми факторами в борьбе с бактериальными патогенами являются: быстрое и точное обнаружение источника инфицирования и контроль распространения бактериальных агентов в окружающей среде.
В современной клинической и лабораторной диагностике используют методы бактериального посева с подсчетом колоний, иммуноферментного анализа и ДНК-анализа для идентификации патогена и определения степени обсемененности анализируемой пробы. Несмотря на широкое распространение, данные методы имеют ряд существенных недостатков. В частности, метод бактериального посева требует значительных временных затрат (2-3 дня) и позволяет определить содержание бактерий в пробе с точностью одного порядка (10 или 100 КОЕ/мл). Методы иммуноферментного анализа и ПЦР являются более экспрессными и точными, однако проведение процедуры определения патогенов требует поддержания специализированных (стерильных) условий, наличия сложного и дорогого оборудования, а также специалистов высокой квалификации. Кроме того, велика вероятность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов, поскольку данные методы не позволяют оценить жизнеспособность определяемых патогенов.
Таким образом, актуальной задачей является разработка новых экспрессных, чувствительных, точных, недорогих и удобных в использовании методов, сенсоров и приборов для определения возбудителей инфекционных заболеваний в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и биологических жидкостях пациентов.
Степень разработанности темы исследований
Разработка высокочувствительных, точных и недорогих биосенсоров, позволяющих быстро обнаружить инфекционные агенты в различных объектах, является актуальным научным направлением. Сочетание простоты, экспрессности и точности обнаружения патогенов с невысокой стоимостью сенсора представляет сложную задачу, одним из путей решения которой является применение сигналообразующей метки, способной быстро и точно генерировать аналитический сигнал в зависимости от количества аналита в исследуемой пробе. Применение в качестве сигналообразующих меток наноматериалов различной природы, в том числе обладающих магнитными свойствами, также является перспективным направлением развития иммуносенсоров, поскольку позволяет избежать использования дорогих и нестабильных при хранении ферментов.
Одним из наиболее перспективных направлений является разработка электрохимических иммуносенсоров с использованием в качестве сигналообразующей метки наноматериалов на основе магнетита. Уникальное сочетание специфичности иммунореакции, магнитных свойств наночастиц и детектирования отклика от метки электрохимическими методами анализа позволит существенно снизить предел обнаружения, увеличить точность определения патогенов, а также снизить себестоимость и временные затраты на проведение анализа.
Диссертационная работа посвящена разработке бесферментных электрохимических иммуносенсоров для определения бактериальных агентов Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 с использованием в качестве прямой сигналообразующей метки наночастиц Fe3O4.
Уникальное сочетание наноразмерности Fe3O4, выраженных магнитных свойств и способности генерировать прямой электрохимический отклик в апротонных средах позволит разработать бесферментный иммуносенсор для быстрого, точного и чувствительного детектирования бактериальных агентов в различных объектах.
Диссертационная работа является частью исследований, проводимых на кафедре аналитической химии Химико -технологического института УрФУ имени Б. Н. Ельцина в рамках госбюджетной темы Н687.42Г.002/12, грантов РФФИ: 09- 03-12242-офи_м, 14-03-01017, гранта для молодых ученых У.М.Н.И.К (тема №6 проект 0011038 2015 года).
Цель диссертационной работы
Разработка бесферментных электрохимических иммуносенсоров для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 с использованием в качестве прямой сигналообразующей метки наночастиц Fe3O4.
Достижение поставленной цели требует решения ряда задач:
• Исследовать строение, состав и морфологические особенности синтезированных методом соосаждения наночастиц состава «Fe3O4- хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан».
• Изучить характер электропревращений наночастиц Fe3O4 в апротонной среде.
• Изучить влияние модифицирующего покрытия на седиментационную устойчивость и электрохимические свойства наночастиц Fe3O4.
• Исследовать кинетические особенности взаимодействия наночастиц «РезО4-хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266
• Осуществить выбор рабочего электрода и оптимального способа модифицирования его поверхности антителами
• Осуществить выбор оптимальных условий формирования иммунокомплекса «антитело - меченая наночастицами бактерия» на поверхности рабочего электрода
• Осуществить разработку алгоритмов проведения процедуры анализа для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266
• Провести анализ бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных суспензиях и реальных пробах с использованием разработанного электрохимического иммуносенсора и референсных лабораторных методов (бактериального посева и ИФА).
Научная новизна и теоретическая значимость работы
• Впервые исследованы особенности электрохимических превращений наночастиц Fe3O4в растворе ацетонитрила, используемых в качестве прямой сигналообразующей метки в разработанных электрохимических иммуносенсорах для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266. Установлено, что характер окислительно-восстановительных превращений наночастиц магнетита на поверхности рабочего электрода в апротонной среде зависит от потенциала предварительного электролиза. Предложены схемы протекания электрохимических превращений наночастиц Fe3O4на поверхности рабочего электрода в апротонной среде после предварительного электролиза при потенциалах -2,5 В и -1,3 В. Выбраны условия формирования прямого электрохимического отклика от Fe3O4 в апротонной среде для дальнейшего использования наночастиц в качестве метки в электрохимическом иммуноанализе.
• Впервые установлено, что покрытие хитозаном и 3 - аминопропилтриэтоксисиланом не влияет на электрохимическую активность наночастиц магнетита в апротонной среде. Обоснована возможность использования наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Fe3O4-3- аминопропилтриэтоксисилан» в качестве прямой сигналообразующей метки для количественного определения бактерий.
• Показано, что наночастицы Fe3O4, модифицированные хитозаном и 3-
аминопропилтриэтоксисиланом, проявляют большую седиментационную устойчивость по сравнению с немодифицированными наночастицами. Изучена кинетика процессов взаимодействия наночастиц <^е3О4-хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266.
• Установлена линейная зависимость величины прямого аналитического сигнала наночастиц магнетита, включенных в иммунокомплекс на поверхности рабочего электрода, от количества бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusв модельных суспензиях.
• Впервые определены чувствительность, точность и селективность разработанных электрохимических иммуносенсоров для детектирования бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 в сравнении с методами бактериального посева и ИФА на модельных суспензиях, смесях бактерий и реальных пробах.
Практическая значимость работы
• Синтезированы наночастицы <^е3О4-хитозан» и «Fe3O4-3-
аминопропилтриэтоксисилан», проявляющие выраженную электрохимическую активность в апротонной среде, для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266. Определены размеры, форма и состав синтезированного материала.
• Разработаны простые, экспрессные и точные бесферментные электрохимические иммуносенсоры для определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 с использованием в качестве метки наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Fe3O4-3-аминопропилтриэтоксисилан» и детектированием прямого аналитического сигнала в апротонной среде.
• Показана и обоснована возможность практического применения разработанных электрохимических иммуносенсоров с прямой детекцией аналитического сигнала от наночастиц Fe3O4 для селективного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 в модельных суспензиях и реальных объектах.
Положения, выносимые на защиту
• Результаты исследований размеров, формы, состава и морфологии наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан», полученные методами электронной микроскопии и ИК-спектроскопии.
• Результаты исследований характера электрохимических превращений наночастиц магнетита в апротонной среде.
• Результаты исследования кинетики взаимодействия наночастиц
«Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266.
• Методики количественного анализа и бесферментные электрохимические иммуносенсоры для определения содержания бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266.
• Результаты количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных смесях и реальных пробах, полученные с использованием разработанных электрохимических иммуносенсоров и подтвержденные в независимой на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск).
Методология и методы исследования
Методологической базой при выполнении диссертационного исследования послужили современные инструментальные методы исследований и теоретические знания о методах и подходах к разработке бесферментных иммуносенсоров для определения бактериальных агентов.
Синтез наночастиц магнетита осуществляли методом соосаждения. Морфологические особенности, размер и форму наночастиц, а также кинетику процессов клеточного эндоцитоза изучали с использованием возможностей электронной микроскопии. Методом ИК-спектроскопии определяли состав модифицированных наночастиц.
Характер электропревращений наноматериалов, чувствительность и стабильность иммуносенсора исследовали методами инверсионной и линейной вольтамперометрии, хроноамперометрии, препаративного электролиза и электрохимической импедансной спектроскопии.
Уникальное сочетание специфичности иммунореакции, магнитных свойств наночастиц Fe3O4и электрохимического детектирования прямого аналитического сигнала в апротонной среде были положены в основу создания бесферментных электрохимических иммуносенсоров для определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266.
Степень достоверности работы
Высокая степень достоверности работы обеспечена применением современных методов исследований и высокотехнологичного оборудования. Достоверность полученных данных подтверждена путем сравнения результатов количественного определения содержания бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных смесях и реальных пробах, полученных с использованием разработанных электрохимических иммуносенсоров и методами ИФА и бактериального посева. Исследования проведены на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», акт испытаний в приложении 1 к полному тексту диссертации.
Апробация работы
Результаты исследований, выполненных в рамках данной диссертационной работы, были представлены на всероссийских и международных конференциях: VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА- 2012» (Уфа-Абзаково, 2012), всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой (Уфа-Абзаково, 2013, 2015), втором съезде аналитиков России (Москва, 2013), конференции «Drug Analysis 2014» (Льеж, Бельгия, 2014), Уральском научном форуме «Современные проблемы органической химии» (Екатеринбург, 2014), конференции «Euroanalysis 2015» (Бордо, Франция, 2015), конференции «Химический анализ и медицина» (Москва, 2015), международной конференции «Recent advances in food analysis» (Прага, Чехия, 2015).
На базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» проведены испытания разработанных электрохимических иммуносенсоров для количественного определения содержания бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных смесях и реальных пробах. На основании проведенных испытаний выдано заключение о том, что разработанный электрохимический иммуносенсор может быть рекомендован к использованию в качестве устройства для экспресс - диагностики бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в лабораториях лечебно-профилактических учреждений и аналитических лабораториях по контролю качества объектов окружающей среды. Акт испытаний в приложении 1 к полному тексту диссертации.
Публикации
По семейным обстоятельствам прошу считать работы Митрофановой Т. С. работами Сваловой Т. С. По результатам проведенных исследований опубликованы: 1 статья в журнале, рекомендуемом ВАК; 1 статья в международном журнале, входящем в базы данных Scopus и Web of Science; 10 тезисов докладов на всероссийских и международных научных конференциях. По результатам работы получен патент на изобретение: Пат. 2538153 РФ. МПК C12N1/02, C12Q1/04, G01N33/00, B82B1/00 Электрохимический способ иммуноанализа для определения микроорганизмов / Козицина А.Н., Митрофанова Т.С., Матерн А.И.; заявл. 22.03.2013: опубл. 20.02.2015, бюл. №1.
Личный вклад автора заключался постановке и проведении научных экспериментов, анализе и систематизации полученных результатов, а также в написании и подготовке к публикации научных статей.
Автор выражает искреннюю благодарность:
д. х. н., профессору заведующему кафедрой аналитической химии химико-технологического института Уральского федерального университета им. Первого президента России Б. Н. Ельцина Матерну Анатолию Ивановичу за помощь в организации проведения научных исследований;
Коллективу ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и лично д.т.н., заведующему лабораторией биофизики и экологических исследований Сафатову Александру Сергеевичу за помощь в организации проведения исследований с клеточными культурами;
Коллективу отдела молодежной науки УрФУ и лично к. т. н., начальнику отдела молодежной науки Корелину Андрею Викторовичу за содействие в организации выездных научных экспериментов.
Структура и объем диссертационной работы
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, и списка литературных источников (246 источников). Текст диссертационной работы изложен на 150 страницах компьютерной верстки, содержит 32 рисунка и 11 таблиц.
Во введении изложены основные положения об актуальности и степени разработанности темы диссертационной работы, определены цели и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость, а также положения, выносимые на защиту диссертации.
В первой главе приведены основные мировые достижения в области разработки биосенсоров для определения бактериальных агентов. Приведено несколько классификаций биосенсоров, показаны принципы работы, достоинства, недостатки и области применения каждого вида биоаналитических устройств. Особое внимание в литературном обзоре уделено иммуносенсорам, где в качестве метки использованы наноматериалы, в том числе и магнитные наночастицы.
Во второй главе представлены сведения о реактивах, материалах, методологической и инструментальной базе диссертационного исследования. Приведены методики синтеза и модифицирования наночастиц магнетита, регистрации ИК-спектров, и получения электронных микрофотографий. Описаны особенности электрохимических исследований наночастиц магнетита в апротонной среде.
Третья глава посвящена исследованию характера электропревращений наночастиц магнетита в апротонном растворе, исследованию влияния факторов внешней среды на процессы формирования прямого электрохимического отклика от наночастиц и получению прямого электрохимического аналитического сигнала для дальнейшего использования в электрохимическом иммуноанализе.
Четвертая глава включает в себя результаты исследований процессов взаимодействия наночастиц магнетита, модифицированных хитозаном и 3- аминопропилтриэтоксисиланом, с клетками грамотрицательных и грамположительных бактерий. В данной главе также приведены результаты сравнительных испытаний стабильности планарных платиновых электродов, модифицированных антителами тремя различными способами. Кроме того, описаны результаты определения целевых бактерий в модельных растворах, смесях различного состава и реальных образцах, полученные с использованием электрохимического иммуносенсора в сравнении с методами ИФА и бактериального посева.
В настоящее время в связи с повсеместным загрязнением объектов окружающей среды, ослаблением производственного контроля качества питьевой воды и продуктов питания, а также снижением иммунитета у населения, имеет место стремительное распространение возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной этиологии. Наиболее распространенным возбудителем инфекционных заболеваний бактериальной этиологии являются бактерии группы кишечной палочки Escherichia coli.Являясь грамотрицательным патогеном, бактерии E. coliв норме населяют нижнюю часть кишечника теплокровных животных и человека. Однако, некоторые штаммы E. coliспособны вызывать самые различные заболевания, включая тяжелые пищевые отравления, перитонит, кольпит и сепсис. Грамположительные бактерии Staphylococcus aureusотносятся к возбудителям множества кожных и инфекционно-токсических заболеваний. Ключевыми факторами в борьбе с бактериальными патогенами являются: быстрое и точное обнаружение источника инфицирования и контроль распространения бактериальных агентов в окружающей среде.
В современной клинической и лабораторной диагностике используют методы бактериального посева с подсчетом колоний, иммуноферментного анализа и ДНК-анализа для идентификации патогена и определения степени обсемененности анализируемой пробы. Несмотря на широкое распространение, данные методы имеют ряд существенных недостатков. В частности, метод бактериального посева требует значительных временных затрат (2-3 дня) и позволяет определить содержание бактерий в пробе с точностью одного порядка (10 или 100 КОЕ/мл). Методы иммуноферментного анализа и ПЦР являются более экспрессными и точными, однако проведение процедуры определения патогенов требует поддержания специализированных (стерильных) условий, наличия сложного и дорогого оборудования, а также специалистов высокой квалификации. Кроме того, велика вероятность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов, поскольку данные методы не позволяют оценить жизнеспособность определяемых патогенов.
Таким образом, актуальной задачей является разработка новых экспрессных, чувствительных, точных, недорогих и удобных в использовании методов, сенсоров и приборов для определения возбудителей инфекционных заболеваний в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и биологических жидкостях пациентов.
Степень разработанности темы исследований
Разработка высокочувствительных, точных и недорогих биосенсоров, позволяющих быстро обнаружить инфекционные агенты в различных объектах, является актуальным научным направлением. Сочетание простоты, экспрессности и точности обнаружения патогенов с невысокой стоимостью сенсора представляет сложную задачу, одним из путей решения которой является применение сигналообразующей метки, способной быстро и точно генерировать аналитический сигнал в зависимости от количества аналита в исследуемой пробе. Применение в качестве сигналообразующих меток наноматериалов различной природы, в том числе обладающих магнитными свойствами, также является перспективным направлением развития иммуносенсоров, поскольку позволяет избежать использования дорогих и нестабильных при хранении ферментов.
Одним из наиболее перспективных направлений является разработка электрохимических иммуносенсоров с использованием в качестве сигналообразующей метки наноматериалов на основе магнетита. Уникальное сочетание специфичности иммунореакции, магнитных свойств наночастиц и детектирования отклика от метки электрохимическими методами анализа позволит существенно снизить предел обнаружения, увеличить точность определения патогенов, а также снизить себестоимость и временные затраты на проведение анализа.
Диссертационная работа посвящена разработке бесферментных электрохимических иммуносенсоров для определения бактериальных агентов Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 с использованием в качестве прямой сигналообразующей метки наночастиц Fe3O4.
Уникальное сочетание наноразмерности Fe3O4, выраженных магнитных свойств и способности генерировать прямой электрохимический отклик в апротонных средах позволит разработать бесферментный иммуносенсор для быстрого, точного и чувствительного детектирования бактериальных агентов в различных объектах.
Диссертационная работа является частью исследований, проводимых на кафедре аналитической химии Химико -технологического института УрФУ имени Б. Н. Ельцина в рамках госбюджетной темы Н687.42Г.002/12, грантов РФФИ: 09- 03-12242-офи_м, 14-03-01017, гранта для молодых ученых У.М.Н.И.К (тема №6 проект 0011038 2015 года).
Цель диссертационной работы
Разработка бесферментных электрохимических иммуносенсоров для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 с использованием в качестве прямой сигналообразующей метки наночастиц Fe3O4.
Достижение поставленной цели требует решения ряда задач:
• Исследовать строение, состав и морфологические особенности синтезированных методом соосаждения наночастиц состава «Fe3O4- хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан».
• Изучить характер электропревращений наночастиц Fe3O4 в апротонной среде.
• Изучить влияние модифицирующего покрытия на седиментационную устойчивость и электрохимические свойства наночастиц Fe3O4.
• Исследовать кинетические особенности взаимодействия наночастиц «РезО4-хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266
• Осуществить выбор рабочего электрода и оптимального способа модифицирования его поверхности антителами
• Осуществить выбор оптимальных условий формирования иммунокомплекса «антитело - меченая наночастицами бактерия» на поверхности рабочего электрода
• Осуществить разработку алгоритмов проведения процедуры анализа для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266
• Провести анализ бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных суспензиях и реальных пробах с использованием разработанного электрохимического иммуносенсора и референсных лабораторных методов (бактериального посева и ИФА).
Научная новизна и теоретическая значимость работы
• Впервые исследованы особенности электрохимических превращений наночастиц Fe3O4в растворе ацетонитрила, используемых в качестве прямой сигналообразующей метки в разработанных электрохимических иммуносенсорах для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266. Установлено, что характер окислительно-восстановительных превращений наночастиц магнетита на поверхности рабочего электрода в апротонной среде зависит от потенциала предварительного электролиза. Предложены схемы протекания электрохимических превращений наночастиц Fe3O4на поверхности рабочего электрода в апротонной среде после предварительного электролиза при потенциалах -2,5 В и -1,3 В. Выбраны условия формирования прямого электрохимического отклика от Fe3O4 в апротонной среде для дальнейшего использования наночастиц в качестве метки в электрохимическом иммуноанализе.
• Впервые установлено, что покрытие хитозаном и 3 - аминопропилтриэтоксисиланом не влияет на электрохимическую активность наночастиц магнетита в апротонной среде. Обоснована возможность использования наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Fe3O4-3- аминопропилтриэтоксисилан» в качестве прямой сигналообразующей метки для количественного определения бактерий.
• Показано, что наночастицы Fe3O4, модифицированные хитозаном и 3-
аминопропилтриэтоксисиланом, проявляют большую седиментационную устойчивость по сравнению с немодифицированными наночастицами. Изучена кинетика процессов взаимодействия наночастиц <^е3О4-хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266.
• Установлена линейная зависимость величины прямого аналитического сигнала наночастиц магнетита, включенных в иммунокомплекс на поверхности рабочего электрода, от количества бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusв модельных суспензиях.
• Впервые определены чувствительность, точность и селективность разработанных электрохимических иммуносенсоров для детектирования бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 в сравнении с методами бактериального посева и ИФА на модельных суспензиях, смесях бактерий и реальных пробах.
Практическая значимость работы
• Синтезированы наночастицы <^е3О4-хитозан» и «Fe3O4-3-
аминопропилтриэтоксисилан», проявляющие выраженную электрохимическую активность в апротонной среде, для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266. Определены размеры, форма и состав синтезированного материала.
• Разработаны простые, экспрессные и точные бесферментные электрохимические иммуносенсоры для определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 с использованием в качестве метки наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Fe3O4-3-аминопропилтриэтоксисилан» и детектированием прямого аналитического сигнала в апротонной среде.
• Показана и обоснована возможность практического применения разработанных электрохимических иммуносенсоров с прямой детекцией аналитического сигнала от наночастиц Fe3O4 для селективного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 в модельных суспензиях и реальных объектах.
Положения, выносимые на защиту
• Результаты исследований размеров, формы, состава и морфологии наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан», полученные методами электронной микроскопии и ИК-спектроскопии.
• Результаты исследований характера электрохимических превращений наночастиц магнетита в апротонной среде.
• Результаты исследования кинетики взаимодействия наночастиц
«Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266.
• Методики количественного анализа и бесферментные электрохимические иммуносенсоры для определения содержания бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266.
• Результаты количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных смесях и реальных пробах, полученные с использованием разработанных электрохимических иммуносенсоров и подтвержденные в независимой на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск).
Методология и методы исследования
Методологической базой при выполнении диссертационного исследования послужили современные инструментальные методы исследований и теоретические знания о методах и подходах к разработке бесферментных иммуносенсоров для определения бактериальных агентов.
Синтез наночастиц магнетита осуществляли методом соосаждения. Морфологические особенности, размер и форму наночастиц, а также кинетику процессов клеточного эндоцитоза изучали с использованием возможностей электронной микроскопии. Методом ИК-спектроскопии определяли состав модифицированных наночастиц.
Характер электропревращений наноматериалов, чувствительность и стабильность иммуносенсора исследовали методами инверсионной и линейной вольтамперометрии, хроноамперометрии, препаративного электролиза и электрохимической импедансной спектроскопии.
Уникальное сочетание специфичности иммунореакции, магнитных свойств наночастиц Fe3O4и электрохимического детектирования прямого аналитического сигнала в апротонной среде были положены в основу создания бесферментных электрохимических иммуносенсоров для определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266.
Степень достоверности работы
Высокая степень достоверности работы обеспечена применением современных методов исследований и высокотехнологичного оборудования. Достоверность полученных данных подтверждена путем сравнения результатов количественного определения содержания бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных смесях и реальных пробах, полученных с использованием разработанных электрохимических иммуносенсоров и методами ИФА и бактериального посева. Исследования проведены на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», акт испытаний в приложении 1 к полному тексту диссертации.
Апробация работы
Результаты исследований, выполненных в рамках данной диссертационной работы, были представлены на всероссийских и международных конференциях: VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА- 2012» (Уфа-Абзаково, 2012), всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой (Уфа-Абзаково, 2013, 2015), втором съезде аналитиков России (Москва, 2013), конференции «Drug Analysis 2014» (Льеж, Бельгия, 2014), Уральском научном форуме «Современные проблемы органической химии» (Екатеринбург, 2014), конференции «Euroanalysis 2015» (Бордо, Франция, 2015), конференции «Химический анализ и медицина» (Москва, 2015), международной конференции «Recent advances in food analysis» (Прага, Чехия, 2015).
На базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» проведены испытания разработанных электрохимических иммуносенсоров для количественного определения содержания бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных смесях и реальных пробах. На основании проведенных испытаний выдано заключение о том, что разработанный электрохимический иммуносенсор может быть рекомендован к использованию в качестве устройства для экспресс - диагностики бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в лабораториях лечебно-профилактических учреждений и аналитических лабораториях по контролю качества объектов окружающей среды. Акт испытаний в приложении 1 к полному тексту диссертации.
Публикации
По семейным обстоятельствам прошу считать работы Митрофановой Т. С. работами Сваловой Т. С. По результатам проведенных исследований опубликованы: 1 статья в журнале, рекомендуемом ВАК; 1 статья в международном журнале, входящем в базы данных Scopus и Web of Science; 10 тезисов докладов на всероссийских и международных научных конференциях. По результатам работы получен патент на изобретение: Пат. 2538153 РФ. МПК C12N1/02, C12Q1/04, G01N33/00, B82B1/00 Электрохимический способ иммуноанализа для определения микроорганизмов / Козицина А.Н., Митрофанова Т.С., Матерн А.И.; заявл. 22.03.2013: опубл. 20.02.2015, бюл. №1.
Личный вклад автора заключался постановке и проведении научных экспериментов, анализе и систематизации полученных результатов, а также в написании и подготовке к публикации научных статей.
Автор выражает искреннюю благодарность:
д. х. н., профессору заведующему кафедрой аналитической химии химико-технологического института Уральского федерального университета им. Первого президента России Б. Н. Ельцина Матерну Анатолию Ивановичу за помощь в организации проведения научных исследований;
Коллективу ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и лично д.т.н., заведующему лабораторией биофизики и экологических исследований Сафатову Александру Сергеевичу за помощь в организации проведения исследований с клеточными культурами;
Коллективу отдела молодежной науки УрФУ и лично к. т. н., начальнику отдела молодежной науки Корелину Андрею Викторовичу за содействие в организации выездных научных экспериментов.
Структура и объем диссертационной работы
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, и списка литературных источников (246 источников). Текст диссертационной работы изложен на 150 страницах компьютерной верстки, содержит 32 рисунка и 11 таблиц.
Во введении изложены основные положения об актуальности и степени разработанности темы диссертационной работы, определены цели и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость, а также положения, выносимые на защиту диссертации.
В первой главе приведены основные мировые достижения в области разработки биосенсоров для определения бактериальных агентов. Приведено несколько классификаций биосенсоров, показаны принципы работы, достоинства, недостатки и области применения каждого вида биоаналитических устройств. Особое внимание в литературном обзоре уделено иммуносенсорам, где в качестве метки использованы наноматериалы, в том числе и магнитные наночастицы.
Во второй главе представлены сведения о реактивах, материалах, методологической и инструментальной базе диссертационного исследования. Приведены методики синтеза и модифицирования наночастиц магнетита, регистрации ИК-спектров, и получения электронных микрофотографий. Описаны особенности электрохимических исследований наночастиц магнетита в апротонной среде.
Третья глава посвящена исследованию характера электропревращений наночастиц магнетита в апротонном растворе, исследованию влияния факторов внешней среды на процессы формирования прямого электрохимического отклика от наночастиц и получению прямого электрохимического аналитического сигнала для дальнейшего использования в электрохимическом иммуноанализе.
Четвертая глава включает в себя результаты исследований процессов взаимодействия наночастиц магнетита, модифицированных хитозаном и 3- аминопропилтриэтоксисиланом, с клетками грамотрицательных и грамположительных бактерий. В данной главе также приведены результаты сравнительных испытаний стабильности планарных платиновых электродов, модифицированных антителами тремя различными способами. Кроме того, описаны результаты определения целевых бактерий в модельных растворах, смесях различного состава и реальных образцах, полученные с использованием электрохимического иммуносенсора в сравнении с методами ИФА и бактериального посева.
1. Методом соосаждения синтезированы наночастицы Fe3O4, обладающие
выраженными магнитными свойствами, используемые в качестве прямых сигналообразующих меток. Средний размер наночастиц составил 10 нм. Полученные наночастицы модифицированы хитозаном и 3-аминопропилтриэтоксисланом. Структура, состав, размеры и форма наночастиц подтверждены методами электронной микроскопии и ИК- спектроскопии.
2. Получен прямой электрохимический отклик от наночастиц магнетита в апротонной среде. Исследованы особенности процессов электропревращений наночастиц магнетита в апротонных растворах. Предложены вероятные механизмы протекания исследуемых процессов:
Fe3O4+ne^> Fen+,Fe0 — me^>Fe2+,Fe3+(n<3;l
4. Исследована кинетика процессов взаимодействия наночастиц «Fe3O4- хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 соответственно. Выбрано оптимальное время взаимодействия бактерий с наночастицами (30 минут в случае обнаружения E. coliи 20 минут в случае обнаружения St. aureus).
5. Получены линейные зависимости прямого аналитического сигнала наночастиц, включенных в иммунокомплекс от концентрации бактерий в модельных суспензиях: Q(мКл)=(0.111±0.003)•lgCE.coli + (0.053±0.009), Q(мКл)=(0.136±0.002)•lgCst.aureus + (0.086±0.008).
6. Разработаны бесферментные электрохимические иммуносенсоры с использованием в качестве прямой сигналообразующей метки наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» для определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в диапазоне 10 - 105КОЕ/мл. Предел обнаружения составил: для бактерий Escherichia coli ATCC 25992 - 9.3 КОЕ/мл, для бактерий Staphylococcus aureus B-1266 - 8.7 КОЕ/мл. Относительное стандартное отклонение не превышает 10%.
7. Точность определения бактерий в модельных суспензиях, и реальных пробах подтверждена методами ИФА и бактериального посева.
Перспективы дальнейшей разработки темы исследований заключаются в расширении круга определяемых бактерий. Однако уже на данном этапе универсальность иммуносенсора не вызывает сомнений, поскольку специфичность определения обусловлена наличием антител на рабочей поверхности сенсора, а способность к эндоцитозу характерна абсолютно для всех бактерий. Кроме того, планируется проведение исследований по адаптации разработанного электрохимического иммуносенсора к определению бактерий в других средах, помимо водных (кровь, слюна, моча, каловые массы, продукты питания и т. д.). Полученные результаты могут стать основой для создания электрохимического экспресс - анализатора для быстрого и точного определения бактерий в полуавтоматическом режиме.
Таким образом, разработанный бесферментный электрохимический иммуносенсор может быть успешно использован в следующих сферах деятельности:
• Экологический мониторинг.
• Производственный контроль сырья и полуфабрикатов на
предприятиях пищевой промышленности.
• Медицинская диагностика инфекционных заболеваний, контроль
распространения бактериальных патогенов, оценка эффективности лечения.
выраженными магнитными свойствами, используемые в качестве прямых сигналообразующих меток. Средний размер наночастиц составил 10 нм. Полученные наночастицы модифицированы хитозаном и 3-аминопропилтриэтоксисланом. Структура, состав, размеры и форма наночастиц подтверждены методами электронной микроскопии и ИК- спектроскопии.
2. Получен прямой электрохимический отклик от наночастиц магнетита в апротонной среде. Исследованы особенности процессов электропревращений наночастиц магнетита в апротонных растворах. Предложены вероятные механизмы протекания исследуемых процессов:
Fe3O4+ne^> Fen+,Fe0 — me^>Fe2+,Fe3+(n<3;l
4. Исследована кинетика процессов взаимодействия наночастиц «Fe3O4- хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 соответственно. Выбрано оптимальное время взаимодействия бактерий с наночастицами (30 минут в случае обнаружения E. coliи 20 минут в случае обнаружения St. aureus).
5. Получены линейные зависимости прямого аналитического сигнала наночастиц, включенных в иммунокомплекс от концентрации бактерий в модельных суспензиях: Q(мКл)=(0.111±0.003)•lgCE.coli + (0.053±0.009), Q(мКл)=(0.136±0.002)•lgCst.aureus + (0.086±0.008).
6. Разработаны бесферментные электрохимические иммуносенсоры с использованием в качестве прямой сигналообразующей метки наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» для определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в диапазоне 10 - 105КОЕ/мл. Предел обнаружения составил: для бактерий Escherichia coli ATCC 25992 - 9.3 КОЕ/мл, для бактерий Staphylococcus aureus B-1266 - 8.7 КОЕ/мл. Относительное стандартное отклонение не превышает 10%.
7. Точность определения бактерий в модельных суспензиях, и реальных пробах подтверждена методами ИФА и бактериального посева.
Перспективы дальнейшей разработки темы исследований заключаются в расширении круга определяемых бактерий. Однако уже на данном этапе универсальность иммуносенсора не вызывает сомнений, поскольку специфичность определения обусловлена наличием антител на рабочей поверхности сенсора, а способность к эндоцитозу характерна абсолютно для всех бактерий. Кроме того, планируется проведение исследований по адаптации разработанного электрохимического иммуносенсора к определению бактерий в других средах, помимо водных (кровь, слюна, моча, каловые массы, продукты питания и т. д.). Полученные результаты могут стать основой для создания электрохимического экспресс - анализатора для быстрого и точного определения бактерий в полуавтоматическом режиме.
Таким образом, разработанный бесферментный электрохимический иммуносенсор может быть успешно использован в следующих сферах деятельности:
• Экологический мониторинг.
• Производственный контроль сырья и полуфабрикатов на
предприятиях пищевой промышленности.
• Медицинская диагностика инфекционных заболеваний, контроль
распространения бактериальных патогенов, оценка эффективности лечения.