Помощь студентам в учебе
РАЗРАБОТКА ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ESCHERICHIA COLI И АНТИГЕНА ВИРУСА КОРИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ Fe3O4
|
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 15
1. Бактериальные патогены и их определение 15
1.1 Обзор стандартных методов идентификации бактерий 17
1.2 Новые методы и подходы в детекции бактерий 19
1.3 Биосенсоры: классификация и применение для идентификации
бактерий 22
1.4 Иммуносенсоры в детектировании бактерий 25
1.4.1 Оптическая иммунодетекция бактерий 27
1.4.2 Электрохимическая иммунодетекция бактерий 28
1.5 Наночастицы в детекции бактерий 33
1.6. Нанокомпозиты в детекции бактерий 38
1.6.1 Получение полимерных нанокомпозитов 40
1.6.2 Применение нанокомпозитов 45
2. Вирусные агенты и их определение 47
3. Постановка задачи 54
ГЛАВА 2. АППАРАТУРА И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА 57
2.1 Оборудование и средства измерений 57
2.2 Реактивы, рабочие растворы 59
2.3 Методики эксперимента 61
2.3.1 Методики получения наночастиц Бе3О4 61
2.3.2 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Те3О4. с
поливинилбензилхлоридным покрытием, модифицированным
гетероциклическими соединениями 61
2.3.3 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Те3О4. с
полипиррольным покрытием (Бе3О4-ПП) 65
2.3.4 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Ре3О4. с ферроценмодифицированной оксидкремниевой оболочкой (Ре 3О4- ФЦ31О2) 66
2.3.6 Методики микроскопических исследований 68
2.3.7 Условия культивирования бактериальных штаммов 69
2.3.8 Методика постановки ИФА 69
ГЛАВА 3. СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОАКТИВНЫХ НАНОКОМПОЗИТНЫХ ЧАСТИЦ НА ОСНОВЕ Ре3О4 72
3.1 Нанокомпозиты с полимерным поливинилбензилхлоридным
покрытием, модифицированным азотсодержащими гетероциклическими соединениями 73
3.2 Нанокомпозиты с электроактивным полимерным покрытием на основе
полипиррола (Ге3О4-ПП) 77
3.3 Нанокомпозиты с ферроценмодифицированным оксидкремниевым
покрытием (Ре3О4-ФЦБЮ2) 82
3.4 Определение динамики изменения размеров агломератов
нанокомпозитных частиц в водных суспензиях 84
3.5 Электрохимические исследования синтезированных нанокомпозитных
частиц 87
3.5.1 Нанокомпозитные частицы с полимерным
поливинилбензилхлоридным покрытием, модифицированным хинолином 87
3.5.2 Нанокомпозитные частицы с электроактивным полимерным
покрытием на основе полипиррола 89
3.5.3 Нанокомпозитные частицы с оксидкремниевым покрытием,
модифицированным ферроценом 91
3.6 Выбор нанокомпозитных частиц для использования в иммуноанализе 94ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА БЕСФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГОМЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕЗИРОВАННЫХ НАНОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ Бе3О4 95
4.1 Микроскопические исследования взаимодействия нанокомпозитных
частиц с бактериальными клетками 95
4.2 Процедура иммуноанализа 99
4.3 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с полимерным
покрытием на основе поливинилбензилхлорида, модифицированного хинолином 101
4.4 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с электроактивным
полипиррольным покрытием 102
4.5 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с электроактивным
ферроценмодифицированным оксидкремниевым покрытием 103
4.6. Определение правильности, специфичности и селективности метода электрохимического иммуноанализа 107
4.7 Анализ реальных объектов 109
ГЛАВА 5. ПРИМЕНЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ С НАНОКОМПОЗИТНЫМИ ЧАСТИЦАМИ С ОКСИДКРЕМНИЕВЫМ ПОКРЫТИЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ 112
5.1 Получение конъюгатов антител с НК на основе Бе3О4 с
оксидкремниевым покрытием (Те3О4 - АТ8Ю2) 112
5.2 Процедура иммуноанализа 114
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 120
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ 122
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 124
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 15
1. Бактериальные патогены и их определение 15
1.1 Обзор стандартных методов идентификации бактерий 17
1.2 Новые методы и подходы в детекции бактерий 19
1.3 Биосенсоры: классификация и применение для идентификации
бактерий 22
1.4 Иммуносенсоры в детектировании бактерий 25
1.4.1 Оптическая иммунодетекция бактерий 27
1.4.2 Электрохимическая иммунодетекция бактерий 28
1.5 Наночастицы в детекции бактерий 33
1.6. Нанокомпозиты в детекции бактерий 38
1.6.1 Получение полимерных нанокомпозитов 40
1.6.2 Применение нанокомпозитов 45
2. Вирусные агенты и их определение 47
3. Постановка задачи 54
ГЛАВА 2. АППАРАТУРА И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТА 57
2.1 Оборудование и средства измерений 57
2.2 Реактивы, рабочие растворы 59
2.3 Методики эксперимента 61
2.3.1 Методики получения наночастиц Бе3О4 61
2.3.2 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Те3О4. с
поливинилбензилхлоридным покрытием, модифицированным
гетероциклическими соединениями 61
2.3.3 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Те3О4. с
полипиррольным покрытием (Бе3О4-ПП) 65
2.3.4 Методика получения нанокомпозитных частиц на основе Ре3О4. с ферроценмодифицированной оксидкремниевой оболочкой (Ре 3О4- ФЦ31О2) 66
2.3.6 Методики микроскопических исследований 68
2.3.7 Условия культивирования бактериальных штаммов 69
2.3.8 Методика постановки ИФА 69
ГЛАВА 3. СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОАКТИВНЫХ НАНОКОМПОЗИТНЫХ ЧАСТИЦ НА ОСНОВЕ Ре3О4 72
3.1 Нанокомпозиты с полимерным поливинилбензилхлоридным
покрытием, модифицированным азотсодержащими гетероциклическими соединениями 73
3.2 Нанокомпозиты с электроактивным полимерным покрытием на основе
полипиррола (Ге3О4-ПП) 77
3.3 Нанокомпозиты с ферроценмодифицированным оксидкремниевым
покрытием (Ре3О4-ФЦБЮ2) 82
3.4 Определение динамики изменения размеров агломератов
нанокомпозитных частиц в водных суспензиях 84
3.5 Электрохимические исследования синтезированных нанокомпозитных
частиц 87
3.5.1 Нанокомпозитные частицы с полимерным
поливинилбензилхлоридным покрытием, модифицированным хинолином 87
3.5.2 Нанокомпозитные частицы с электроактивным полимерным
покрытием на основе полипиррола 89
3.5.3 Нанокомпозитные частицы с оксидкремниевым покрытием,
модифицированным ферроценом 91
3.6 Выбор нанокомпозитных частиц для использования в иммуноанализе 94ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА БЕСФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГОМЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕЗИРОВАННЫХ НАНОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ Бе3О4 95
4.1 Микроскопические исследования взаимодействия нанокомпозитных
частиц с бактериальными клетками 95
4.2 Процедура иммуноанализа 99
4.3 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с полимерным
покрытием на основе поливинилбензилхлорида, модифицированного хинолином 101
4.4 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с электроактивным
полипиррольным покрытием 102
4.5 Применение в иммуноанализе нанокомпозитов с электроактивным
ферроценмодифицированным оксидкремниевым покрытием 103
4.6. Определение правильности, специфичности и селективности метода электрохимического иммуноанализа 107
4.7 Анализ реальных объектов 109
ГЛАВА 5. ПРИМЕНЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ С НАНОКОМПОЗИТНЫМИ ЧАСТИЦАМИ С ОКСИДКРЕМНИЕВЫМ ПОКРЫТИЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ 112
5.1 Получение конъюгатов антител с НК на основе Бе3О4 с
оксидкремниевым покрытием (Те3О4 - АТ8Ю2) 112
5.2 Процедура иммуноанализа 114
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 120
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ 122
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 124
Актуальность темы
В связи с увеличением плотности населения, проблема инфекционного загрязнения биологических и природных объектов актуальна как для стран «третьего мира», так и для развитых стран. Быстрое обнаружение инфекционных агентов чрезвычайно важно для эффективной профилактики и лечения бактериальных и вирусных инфекций.
Среди большого разнообразия бактерий, вызывающих инфекционные заболевания у людей и животных, одними из наиболее распространенных являются Escherichia coli.Среди штаммов E. coliвстречаются как условно-патогенные, так и патогенные, вызывающие заболевания разной степени тяжести и приводящие к смерти у пожилых людей, детей и лиц с ослабленным иммунитетом. Ввиду сходной внутривидовой физиологии E.coli,для исследовательских целей в качестве модельной системы чаще всего используют условно-патогенные штаммы (например, ATCC 25922). Для моделирования вирусных агентов при проведении исследований во многих случаях (в том числе в целях биобезопасности) целесообразно использовать соответствующие антигены.
В медицинской практике для идентификации и определения концентрации бактерий и вирусов в различных объектах используются методы: бактериального посева, ПЦР, ИФА. Основными недостатками метода бактериального посева являются его длительность (от 3-х дней) и высокие требования к стерильности лаборатории. Опосредованное определение возбудителя инфекции методом ИФА путем измерения количества выработавшихся антител может дать искаженный результат в случае запоздалого или слабого иммунного ответа организма. Кроме того, ИФА требует применения нестабильных при хранении ферментов. При анализе методом ПЦР существует вероятность получения ложноположительных результатов, т.к. данный метод не способен «отличить» мертвую инфекцию от живой. Актуальным вопросом является разработка недорогих экспрессных методов, которые возможно реализовать в небольших лабораториях, в полевых условиях или «у постели» больного.
Степень разработанности темы исследования
Применение для детекции инфекционных агентов электрохимических методов, позволяющих быстро и с высокой точностью определять различные аналиты в объектах биологического и природного происхождения, с использованием относительно недорогого оборудования, активно обсуждается в литературе. С другой стороны, еще одним перспективным направлением является использование в разработке методов обнаружения инфекционных агентов наноматериалов. Особый интерес представляет применение нанокомпозитных частиц, сочетающих в себе магнитное ядро и функциональное полимерное покрытие.
Сочетание простоты, доступности и чувствительности электрохимических методов с последними достижениями в области нанотехнологий позволит разработать новые экспрессные, чувствительные и селективные методы и сенсоры, а также исключить применение ферментов при определении бактерий и вирусов.
Настоящая диссертационная работа посвящена разработке бесферментного метода электрохимического иммуноанализа с использованием нанокомпозитов (НК) на основе магнитных нанокомпозитных частиц на основе Ре3О4 в качестве сигналообразующей метки.
Сочетание магнитных свойств Ре3О4 и электроактивного покрытия нанокомпозита, генерирующего прямой стабильный, хорошо выраженный электрохимический сигнал, даст возможность упростить, удешевить и ускорить процедуру определения бактерий в биологических и природных объектах. Синтез и применение конъюгатов антител с магнитными нанокомпозитными частицами позволит разработать простой и чувствительный метод определения антигенов вирусов в биологических объектах.
Работа является частью исследований, проводимых на кафедре аналитической химии Химико-технологического института УрФУ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина в рамках госбюджетной темы Н687.42Г.002/12, поддержана грантами РФФИ: О9-03-12242-офи_м, 14-03-01017, грантом У.М.Н.И.К. (тема №9, проекта 14151).
Цель диссертационной работы
Разработка бесферментного электрохимического иммуносенсора и метода для количественного определения:
- бактерий (на примере Е.соИ АТСС 25922) с использованием нанокомпозитных частиц Ре3О4 с электроактивным покрытием в качестве сигналообразующей метки;
- антигенов вирусов (на примере антигена вируса кори ИОУО/96) с использованием конъюгатов антител и магнитных нанокомпозитных частиц.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- осуществить выбор метода синтеза позволяющий получить нанокомпозитные частицы постоянного состава с магнитным ядром и электроактивным покрытием, генерирующим стабильный сигнал, с размерами, позволяющими проходить сквозь клеточную мембрану бактерии (не >300 нм);
- осуществить выбор способа получениям конъюгатов антител к вирусу с нанокомпозитными частицами;
- осуществить выбор нанокомпозитных частиц, генерирующих адекватный, чувствительный, легко измеряемый аналитический отклик для использования в качестве «метки»;
исследовать морфологию полученных нанокомпозитных частиц методами просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения с электронной дифракцией, ИК-спектроскопии;
- изучить электрохимические свойства синтезированных нанокомпозитных частиц;
- осуществить выбор условий и способ иммобилизации электроактивных нанокомпозитных частиц на поверхности бактериальной клетки;
- осуществить выбор условий формирования «прямого» электрохимического аналитического сигнала после взаимодействия нанокомпозитных частиц с бактериями;
- осуществить разработку алгоритма проведения иммуноанализа для определения содержания бактерий / антигенов вирусов;
- осуществить выбор условий проведения процедуры иммуноанализа для определения содержания бактерий / антигенов вирусов;
- провести анализ модельных растворов, содержащих микроорганизмы;
- сравнить результаты анализа проб, полученных с использованием предложенного электрохимического метода иммуноанализа и традиционно используемых методов (ИФА и бактериального посева).
Научная новизна работы
• Методом электронной микроскопии исследованы размер, форма и степень агрегированности синтезированных по оригинальным методикам НК на основе Ре3О4, с электроактивным покрытием (полипиррол; поливинилбензилхлорид, модифицированный хинолином; оксид кремния, модифицированный ферроценом), а также скорость и мера проникновения их в клетку бактерии Е.соИ. Установлено, что размер НК зависит от используемого метода полимеризации. Метод эмульсионной полимеризации и золь-гель метод, в отличие от метода 1н-Пи, позволили получить НК размером < 100 нм. Показано, что степень и скорость проникновения в клетку зависит от природы покрытия НК.
• Исследованы электрохимические свойства НК. Показано, что все виды синтезированных НК проявляют электрохимическую активность в рабочем диапазоне потенциалов водных растворов от -1 до +1 В, что позволяет использовать их в качестве сигналообразующей метки в водных средах.
• Впервые показана возможность использования в электрохимическом бесферментном иммуноанализе синтезированных магнитных НК в качестве «прямой» сигналообразующей метки. Установлена линейная зависимость между величиной прямого электрохимического отклика НК - «метки», входящей в состав иммунокомплекса и концентрацией бактерий в пробе. Установлено оптимальное время инкубации НК с бактериями и время образования иммунокомплекса.
• Найдены оптимальные условия проведения процедуры иммуноанализа,
обеспечивающие экспрессное (1анализа = 60 мин), чувствительное (диапазон линейности 2.3-102 - 2.3-107 КОЕ/мл) и специфичное количественное детектирование бактерий Е.соИ. Показана применимость разработанного подхода к определению содержания Е.соИ в реальных объектах (пробах воды и воздуха). Установлено, что на результат количественного определения целевого аналита не влияет присутствие в пробе бактерий других видов.
• Показана и обоснована возможность применения разработанного гибридного варианта иммуноанализа с использованием конъюгатов антител с магнитными НК, для селективного определения антигена вируса кори в модельной системе. Установлено влияние на величину сигнала времени инкубации конъюгата с антигеном и времени образования «сэндвич» - иммунокомплекса.
Практическая значимость работы
• Получены по оригинальным методикам электрохимически активные нанокомпозитные частицы с узким распределением по размерам, определенной формы, состава, структуры и конъюгаты антител с НК на основе Ре3О4 с оксидкремниевым покрытием.
• С использованием предложенного иммуносенсора и алгоритма гибридного иммуноэлектрохимического метода анализа с использованием синтезированных электроактивных нанокомпозитных частиц разработан метод иммуноанализа для определения бактерий.
• Проведены исследования по сравнительному определению содержания бактерии E.coliв модельных и реальных объектах с использованием разработанного иммуносенсора и традиционно-используемых методов ИФА и бактериального посева (проведены в лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск)).
• Разработан подход к определению антигенов вирусов методом электрохимического иммуноанализа с использованием конъюгатов антител с НК.
Положения, выносимые на защиту
• Оригинальные методики получения стабильных во времени электрохимически активных НК на основе Fe3O4с хинолин- модифицированным поливинилбензилхлоридным покрытием, покрытием из полипиррола, ферроценмодифицированным оксидкремниевым покрытием с узким распределением по размерам, определенной формы, состава, структуры.
• Результаты ИК-спектроскопии подтверждающие наличие электроактивного полимерного покрытия на наночастицах Fe3O4.
• Результаты исследований размеров, формы и морфологии синтезированных НК, полученные с помощью микроскопии высокого разрешения с электронной дифракцией и метода динамического светорассеяния.
• Результаты электрохимических исследований синтезированных НК.
• Результаты исследования взаимодействия синтезированных НК на основе Fe3O4с различными электроактивными полимерными покрытиями с культурой бактерии E.coli.
• Иммуносенсор и метод электрохимического определения содержания бактерии E.coli.
• Результаты определения с использованием разработанного иммуносенсора и метода содержания бактерии E.coliв реальных объектах, подтвержденные данными полученными в независимой лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск) методами ИФА и бактериального посева.
• Метод электрохимического иммуноанализа для определения антигенов вирусов на примере антигена вируса кори NovO/96.
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационного исследования послужили существующие в мире теоретические и экспериментальные наработки по синтезу нанокомпозитных частиц, а также методам подтверждения их состава и установления размерных характеристик. В основе работы лежат современные методы и подходы к определению бактериальных и вирусных агентов в пробах различного происхождения с использованием нанокомпозитных материалов.
При синтезе наночастиц и НК использовали методы соосаждения, полимеризации in situи эмульсионной полимеризации. Морфологию, размерные характеристики НК и взаимодействие бактериальных клеток с НК изучали методом электронной микроскопии. Для исследования электрохимических свойств НК и при разработке метода иммуноанализа, использовали методы циклической, линейной и инверсионной вольтамперометрии.
Применение электрохимических методов в сочетании с использованием магнитных нанокомпозитных частиц, а также иммуннореакция, лежащая в основе метода иммуноанализа, позволяет разработать экспрессный, чувствительный и селективный сенсор для определения инфекционных агентов.
Апробация работы
Основные результаты исследований представлены на следующих мероприятиях: конференции «Аналитическая химия - новые методы и возможности», (Москва, 2010), симпозиуме «Теория и практика электроаналитической химии», г. Томск, 2010), конференции «Актуальные проблемы органического синтеза и анализа» (Екатеринбург, Россия, 2010), XXI Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2011), научной конференции «Достижения в химии и химической технологии» (Екатеринбург, 2011), международной конференции «9-th spring Meeting of the International Society of Electrochemistry, Electrochemical Sensors: from nanoscale engineering to industrial application» (Турку, Финляндия, 2011), научной школе по аналитической химии (Краснодар, 2011), III всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2011), на VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА- 2012» (Абзаково, 2012), международной конференции «Nanoformulation - 2012» (Барселона, Испания, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Физика и химия наноразмерных систем» (Екатеринбург, 2012), IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа-Абзаково, 2013), «Втором съезде аналитиков России (Москва, 2013), Уральском научном форуме «Современные проблемы органической химии» (Екатеринбург, 2014), II научно-технической конференции аспирантов и молодых ученых «Химия в федеральных университетах» (Екатеринбург, 2014).
На основе результатов работы получены патенты: РФ 2542487. МПК C12Q 1/04, C12N 1/02, G01N 33/53, B82B 1/00 Способ определения содержания грамотрицательных патогенных бактерий в анализируемой среде / Козицина А.Н., Малышева Н.Н., Глазырина Ю.А., Матерн А.И.; заявл. 15.07.2013: опубл. 20.02.2015, бюлл.№5;
РФ2550955. МПК С0Ш33/58, С0Ш33/53 Способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов / Козицина А.Н., Малышева Н.Н., Глазырина Ю.А., Матерн А.И., Иванова А.В.; заявл. 11.12.2013: опубл. 20.05.2015, бюлл.№14.
Публикации
По результатам исследований опубликованы 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, 2 патента и 14 тезисов докладов на конференциях различного уровня.
Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в решении ключевых задач, проведении основных экспериментальных исследований в области синтеза НК, в изучении их электрохимического поведения, интерпретации, систематизации полученных результатов, разработке метода и сенсора для электрохимического определения бактерии Е.соИ и антигена вируса кори.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 5-ти глав, выводов, списка использованных библиографических источников (194 источника).
Диссертация изложена на 147 страницах компьютерной верстки, содержит 37 рисунков, 14 таблиц.
Во введении раскрыта актуальность и степень разработанности темы исследования, определены цели и задачи, сформулирована научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту.
В первой главе представлен анализ литературных данных о современном состоянии методов определения бактериальных патогенов в модельных и реальных объектах. Особое внимание уделено рассмотрению биосенсоров и их применению для идентификации инфекционных агентов. Рассмотрены варианты использования на различных стадиях иммуноанализа наночастиц и нанокомпозитов типа «ядро-оболочка». Представлен краткий обзор современных способов определения вирусных агентов. Проведен анализ достоинств и недостатков существующих методов, перспективных направлений разработки новых методов и сенсоров.
Во второй главе представлены сведения о реагентах, материалах и оборудовании, использованных в работе. Изложены методики синтеза нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4с электроактивным полимерным покрытием на основе полипиррола, модифицированного хинолином поливинилбензилхлорида, модифицированного ферроценом оксида кремния. Приведены методики подготовки образцов для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии нанокомпозитных частиц и клеток культуры E.coliпосле взаимодействия с НК.
Третья глава посвящена синтезу и результатам ИК-спектроскопии, подтверждающим состав синтезированных нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4с электроактивным полимерным покрытием, результатам определения методом просвечивающей электронной микроскопии размера и формы НК и исследованию их электрохимических свойств.
Четвертая глава посвящена разработке бесферментного электрохимического иммуносенсора и метода определения содержания бактерий E.coliв модельных и реальных объектах с использованием синтезированных нанокомпозитов на основе Fe3O4с электроактивным полимерным покрытием. Представлены результаты и интерпретация экспериментов по сравнительному определению концентрации E.coliв модельных и реальных объектах разработанным методом и референсными методами: ИФА и бактериального посева.
Пятая глава посвящена синтезу и применению для определения антигена вируса кори конъюгатов нанокомпозитных частиц с оксидкремниевым покрытием и антителами. Представлена разработанная схема метода иммуноанализа и результаты определения антигена вируса (на примере антигена вируса кори NovO/96) в модельной системе. Проведен статистический анализ полученных результатов.
В связи с увеличением плотности населения, проблема инфекционного загрязнения биологических и природных объектов актуальна как для стран «третьего мира», так и для развитых стран. Быстрое обнаружение инфекционных агентов чрезвычайно важно для эффективной профилактики и лечения бактериальных и вирусных инфекций.
Среди большого разнообразия бактерий, вызывающих инфекционные заболевания у людей и животных, одними из наиболее распространенных являются Escherichia coli.Среди штаммов E. coliвстречаются как условно-патогенные, так и патогенные, вызывающие заболевания разной степени тяжести и приводящие к смерти у пожилых людей, детей и лиц с ослабленным иммунитетом. Ввиду сходной внутривидовой физиологии E.coli,для исследовательских целей в качестве модельной системы чаще всего используют условно-патогенные штаммы (например, ATCC 25922). Для моделирования вирусных агентов при проведении исследований во многих случаях (в том числе в целях биобезопасности) целесообразно использовать соответствующие антигены.
В медицинской практике для идентификации и определения концентрации бактерий и вирусов в различных объектах используются методы: бактериального посева, ПЦР, ИФА. Основными недостатками метода бактериального посева являются его длительность (от 3-х дней) и высокие требования к стерильности лаборатории. Опосредованное определение возбудителя инфекции методом ИФА путем измерения количества выработавшихся антител может дать искаженный результат в случае запоздалого или слабого иммунного ответа организма. Кроме того, ИФА требует применения нестабильных при хранении ферментов. При анализе методом ПЦР существует вероятность получения ложноположительных результатов, т.к. данный метод не способен «отличить» мертвую инфекцию от живой. Актуальным вопросом является разработка недорогих экспрессных методов, которые возможно реализовать в небольших лабораториях, в полевых условиях или «у постели» больного.
Степень разработанности темы исследования
Применение для детекции инфекционных агентов электрохимических методов, позволяющих быстро и с высокой точностью определять различные аналиты в объектах биологического и природного происхождения, с использованием относительно недорогого оборудования, активно обсуждается в литературе. С другой стороны, еще одним перспективным направлением является использование в разработке методов обнаружения инфекционных агентов наноматериалов. Особый интерес представляет применение нанокомпозитных частиц, сочетающих в себе магнитное ядро и функциональное полимерное покрытие.
Сочетание простоты, доступности и чувствительности электрохимических методов с последними достижениями в области нанотехнологий позволит разработать новые экспрессные, чувствительные и селективные методы и сенсоры, а также исключить применение ферментов при определении бактерий и вирусов.
Настоящая диссертационная работа посвящена разработке бесферментного метода электрохимического иммуноанализа с использованием нанокомпозитов (НК) на основе магнитных нанокомпозитных частиц на основе Ре3О4 в качестве сигналообразующей метки.
Сочетание магнитных свойств Ре3О4 и электроактивного покрытия нанокомпозита, генерирующего прямой стабильный, хорошо выраженный электрохимический сигнал, даст возможность упростить, удешевить и ускорить процедуру определения бактерий в биологических и природных объектах. Синтез и применение конъюгатов антител с магнитными нанокомпозитными частицами позволит разработать простой и чувствительный метод определения антигенов вирусов в биологических объектах.
Работа является частью исследований, проводимых на кафедре аналитической химии Химико-технологического института УрФУ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина в рамках госбюджетной темы Н687.42Г.002/12, поддержана грантами РФФИ: О9-03-12242-офи_м, 14-03-01017, грантом У.М.Н.И.К. (тема №9, проекта 14151).
Цель диссертационной работы
Разработка бесферментного электрохимического иммуносенсора и метода для количественного определения:
- бактерий (на примере Е.соИ АТСС 25922) с использованием нанокомпозитных частиц Ре3О4 с электроактивным покрытием в качестве сигналообразующей метки;
- антигенов вирусов (на примере антигена вируса кори ИОУО/96) с использованием конъюгатов антител и магнитных нанокомпозитных частиц.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- осуществить выбор метода синтеза позволяющий получить нанокомпозитные частицы постоянного состава с магнитным ядром и электроактивным покрытием, генерирующим стабильный сигнал, с размерами, позволяющими проходить сквозь клеточную мембрану бактерии (не >300 нм);
- осуществить выбор способа получениям конъюгатов антител к вирусу с нанокомпозитными частицами;
- осуществить выбор нанокомпозитных частиц, генерирующих адекватный, чувствительный, легко измеряемый аналитический отклик для использования в качестве «метки»;
исследовать морфологию полученных нанокомпозитных частиц методами просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения с электронной дифракцией, ИК-спектроскопии;
- изучить электрохимические свойства синтезированных нанокомпозитных частиц;
- осуществить выбор условий и способ иммобилизации электроактивных нанокомпозитных частиц на поверхности бактериальной клетки;
- осуществить выбор условий формирования «прямого» электрохимического аналитического сигнала после взаимодействия нанокомпозитных частиц с бактериями;
- осуществить разработку алгоритма проведения иммуноанализа для определения содержания бактерий / антигенов вирусов;
- осуществить выбор условий проведения процедуры иммуноанализа для определения содержания бактерий / антигенов вирусов;
- провести анализ модельных растворов, содержащих микроорганизмы;
- сравнить результаты анализа проб, полученных с использованием предложенного электрохимического метода иммуноанализа и традиционно используемых методов (ИФА и бактериального посева).
Научная новизна работы
• Методом электронной микроскопии исследованы размер, форма и степень агрегированности синтезированных по оригинальным методикам НК на основе Ре3О4, с электроактивным покрытием (полипиррол; поливинилбензилхлорид, модифицированный хинолином; оксид кремния, модифицированный ферроценом), а также скорость и мера проникновения их в клетку бактерии Е.соИ. Установлено, что размер НК зависит от используемого метода полимеризации. Метод эмульсионной полимеризации и золь-гель метод, в отличие от метода 1н-Пи, позволили получить НК размером < 100 нм. Показано, что степень и скорость проникновения в клетку зависит от природы покрытия НК.
• Исследованы электрохимические свойства НК. Показано, что все виды синтезированных НК проявляют электрохимическую активность в рабочем диапазоне потенциалов водных растворов от -1 до +1 В, что позволяет использовать их в качестве сигналообразующей метки в водных средах.
• Впервые показана возможность использования в электрохимическом бесферментном иммуноанализе синтезированных магнитных НК в качестве «прямой» сигналообразующей метки. Установлена линейная зависимость между величиной прямого электрохимического отклика НК - «метки», входящей в состав иммунокомплекса и концентрацией бактерий в пробе. Установлено оптимальное время инкубации НК с бактериями и время образования иммунокомплекса.
• Найдены оптимальные условия проведения процедуры иммуноанализа,
обеспечивающие экспрессное (1анализа = 60 мин), чувствительное (диапазон линейности 2.3-102 - 2.3-107 КОЕ/мл) и специфичное количественное детектирование бактерий Е.соИ. Показана применимость разработанного подхода к определению содержания Е.соИ в реальных объектах (пробах воды и воздуха). Установлено, что на результат количественного определения целевого аналита не влияет присутствие в пробе бактерий других видов.
• Показана и обоснована возможность применения разработанного гибридного варианта иммуноанализа с использованием конъюгатов антител с магнитными НК, для селективного определения антигена вируса кори в модельной системе. Установлено влияние на величину сигнала времени инкубации конъюгата с антигеном и времени образования «сэндвич» - иммунокомплекса.
Практическая значимость работы
• Получены по оригинальным методикам электрохимически активные нанокомпозитные частицы с узким распределением по размерам, определенной формы, состава, структуры и конъюгаты антител с НК на основе Ре3О4 с оксидкремниевым покрытием.
• С использованием предложенного иммуносенсора и алгоритма гибридного иммуноэлектрохимического метода анализа с использованием синтезированных электроактивных нанокомпозитных частиц разработан метод иммуноанализа для определения бактерий.
• Проведены исследования по сравнительному определению содержания бактерии E.coliв модельных и реальных объектах с использованием разработанного иммуносенсора и традиционно-используемых методов ИФА и бактериального посева (проведены в лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск)).
• Разработан подход к определению антигенов вирусов методом электрохимического иммуноанализа с использованием конъюгатов антител с НК.
Положения, выносимые на защиту
• Оригинальные методики получения стабильных во времени электрохимически активных НК на основе Fe3O4с хинолин- модифицированным поливинилбензилхлоридным покрытием, покрытием из полипиррола, ферроценмодифицированным оксидкремниевым покрытием с узким распределением по размерам, определенной формы, состава, структуры.
• Результаты ИК-спектроскопии подтверждающие наличие электроактивного полимерного покрытия на наночастицах Fe3O4.
• Результаты исследований размеров, формы и морфологии синтезированных НК, полученные с помощью микроскопии высокого разрешения с электронной дифракцией и метода динамического светорассеяния.
• Результаты электрохимических исследований синтезированных НК.
• Результаты исследования взаимодействия синтезированных НК на основе Fe3O4с различными электроактивными полимерными покрытиями с культурой бактерии E.coli.
• Иммуносенсор и метод электрохимического определения содержания бактерии E.coli.
• Результаты определения с использованием разработанного иммуносенсора и метода содержания бактерии E.coliв реальных объектах, подтвержденные данными полученными в независимой лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск) методами ИФА и бактериального посева.
• Метод электрохимического иммуноанализа для определения антигенов вирусов на примере антигена вируса кори NovO/96.
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационного исследования послужили существующие в мире теоретические и экспериментальные наработки по синтезу нанокомпозитных частиц, а также методам подтверждения их состава и установления размерных характеристик. В основе работы лежат современные методы и подходы к определению бактериальных и вирусных агентов в пробах различного происхождения с использованием нанокомпозитных материалов.
При синтезе наночастиц и НК использовали методы соосаждения, полимеризации in situи эмульсионной полимеризации. Морфологию, размерные характеристики НК и взаимодействие бактериальных клеток с НК изучали методом электронной микроскопии. Для исследования электрохимических свойств НК и при разработке метода иммуноанализа, использовали методы циклической, линейной и инверсионной вольтамперометрии.
Применение электрохимических методов в сочетании с использованием магнитных нанокомпозитных частиц, а также иммуннореакция, лежащая в основе метода иммуноанализа, позволяет разработать экспрессный, чувствительный и селективный сенсор для определения инфекционных агентов.
Апробация работы
Основные результаты исследований представлены на следующих мероприятиях: конференции «Аналитическая химия - новые методы и возможности», (Москва, 2010), симпозиуме «Теория и практика электроаналитической химии», г. Томск, 2010), конференции «Актуальные проблемы органического синтеза и анализа» (Екатеринбург, Россия, 2010), XXI Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2011), научной конференции «Достижения в химии и химической технологии» (Екатеринбург, 2011), международной конференции «9-th spring Meeting of the International Society of Electrochemistry, Electrochemical Sensors: from nanoscale engineering to industrial application» (Турку, Финляндия, 2011), научной школе по аналитической химии (Краснодар, 2011), III всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2011), на VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА- 2012» (Абзаково, 2012), международной конференции «Nanoformulation - 2012» (Барселона, Испания, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Физика и химия наноразмерных систем» (Екатеринбург, 2012), IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа-Абзаково, 2013), «Втором съезде аналитиков России (Москва, 2013), Уральском научном форуме «Современные проблемы органической химии» (Екатеринбург, 2014), II научно-технической конференции аспирантов и молодых ученых «Химия в федеральных университетах» (Екатеринбург, 2014).
На основе результатов работы получены патенты: РФ 2542487. МПК C12Q 1/04, C12N 1/02, G01N 33/53, B82B 1/00 Способ определения содержания грамотрицательных патогенных бактерий в анализируемой среде / Козицина А.Н., Малышева Н.Н., Глазырина Ю.А., Матерн А.И.; заявл. 15.07.2013: опубл. 20.02.2015, бюлл.№5;
РФ2550955. МПК С0Ш33/58, С0Ш33/53 Способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов / Козицина А.Н., Малышева Н.Н., Глазырина Ю.А., Матерн А.И., Иванова А.В.; заявл. 11.12.2013: опубл. 20.05.2015, бюлл.№14.
Публикации
По результатам исследований опубликованы 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, 2 патента и 14 тезисов докладов на конференциях различного уровня.
Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в решении ключевых задач, проведении основных экспериментальных исследований в области синтеза НК, в изучении их электрохимического поведения, интерпретации, систематизации полученных результатов, разработке метода и сенсора для электрохимического определения бактерии Е.соИ и антигена вируса кори.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 5-ти глав, выводов, списка использованных библиографических источников (194 источника).
Диссертация изложена на 147 страницах компьютерной верстки, содержит 37 рисунков, 14 таблиц.
Во введении раскрыта актуальность и степень разработанности темы исследования, определены цели и задачи, сформулирована научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту.
В первой главе представлен анализ литературных данных о современном состоянии методов определения бактериальных патогенов в модельных и реальных объектах. Особое внимание уделено рассмотрению биосенсоров и их применению для идентификации инфекционных агентов. Рассмотрены варианты использования на различных стадиях иммуноанализа наночастиц и нанокомпозитов типа «ядро-оболочка». Представлен краткий обзор современных способов определения вирусных агентов. Проведен анализ достоинств и недостатков существующих методов, перспективных направлений разработки новых методов и сенсоров.
Во второй главе представлены сведения о реагентах, материалах и оборудовании, использованных в работе. Изложены методики синтеза нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4с электроактивным полимерным покрытием на основе полипиррола, модифицированного хинолином поливинилбензилхлорида, модифицированного ферроценом оксида кремния. Приведены методики подготовки образцов для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии нанокомпозитных частиц и клеток культуры E.coliпосле взаимодействия с НК.
Третья глава посвящена синтезу и результатам ИК-спектроскопии, подтверждающим состав синтезированных нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4с электроактивным полимерным покрытием, результатам определения методом просвечивающей электронной микроскопии размера и формы НК и исследованию их электрохимических свойств.
Четвертая глава посвящена разработке бесферментного электрохимического иммуносенсора и метода определения содержания бактерий E.coliв модельных и реальных объектах с использованием синтезированных нанокомпозитов на основе Fe3O4с электроактивным полимерным покрытием. Представлены результаты и интерпретация экспериментов по сравнительному определению концентрации E.coliв модельных и реальных объектах разработанным методом и референсными методами: ИФА и бактериального посева.
Пятая глава посвящена синтезу и применению для определения антигена вируса кори конъюгатов нанокомпозитных частиц с оксидкремниевым покрытием и антителами. Представлена разработанная схема метода иммуноанализа и результаты определения антигена вируса (на примере антигена вируса кори NovO/96) в модельной системе. Проведен статистический анализ полученных результатов.
1. С использованием оригинальных методик синтезированы НК на основе магнетита (Fe3O4) с полимерным покрытием из полипиррола (средний размер 170 нм); поливинилбензилхлорида, модифицированного хинолином (средний размер 20 нм); оксида кремния модифицированного ферроценом / антителами (средний размер 20 нм). Структура и размерность каждого вида НК подтверждены методом ИК-спектроскопии и просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения с электронной дифракцией [192].
2. Исследована возможность применения магнитных нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4с электроактивным полимерным покрытием в качестве «метки», генерирующей адекватный, чувствительный, легко измеряемый аналитический электрохимический отклик.
3. Показано взаимодействие синтезированных нанокомпозитов всех типов с клетками бактерии E.coli.
4. Разработаны новый электрохимический иммуносенсор и метод определения бактерий (на примере E.coliштамм ATC 25922) с использованием нанокомпозитных частиц Fe3O4- ферроценмодифицированный оксид кремния в качестве метки в диапазоне концентраций 2.3-102 - 2.3-107 КОЕ/мл Предел обнаружения составляет 1.2-101 КОЕ/мл [193].
5. Надежность и правильность результатов определения содержания E.coliв модельных системах и реальных объектах (пробы воды и воздуха) подтверждены сравнением данных полученных с применением разработанного и стандартных методов (бактериального посева и ИФА).
6. Разработан метод электрохимического определения антигенов вирусов (на примере антигена вируса кори) с использованием конъюгатов антител с нанокомпозитными частицами Fe3O4- SiO2в диапазоне концентраций 2.33-10-4 - 2.33 мг/мл. Предел обнаружения составляет 1.87-10-5 мг/мл [194].
Перспективы дальнейшей разработки темы заключаются в проведении испытаний с использованием разработанного электрохимического метода иммуноанализа и сенсора для количественного определения бактерий других видов (помимо Е.соИ}. Уверенность в успешном достижении цели основана на применении оригинальной схемы иммуноанализа, включающей высокоспецифичную иммунореакцию на поверхности сенсора и высокочувствительную электрохимическую детекцию.
Кроме того, будет проведена адаптация разработанного метода и сенсора для определения содержания различных патогенов в реальных объектах (кровь, слюна, испражнения, назальные смывы и др.) с целью аттестации методики количественного определения в сравнении со стандартно-используемыми методами.
Основные исследования по определению вирусных агентов, с использованием синтезированных конъюгатов «антитела - нанокомпозитные частицы» будут направлены на перенос метода с модельных систем на реальные объекты и, также на расширение круга определяемых вирусов.
Таким образом, в дальнейшем разработанные иммуносенсоры и методики определения инфекционных агентов могут быть применены в следующих научных областях:
• Медицинская диагностика: в лечебно-профилактических учреждениях для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний на ранних стадиях.
• Экологический контроль и безопасность жизнедеятельности (учреждения
Роспотребнадзора): мониторинг среды обитания и контроль бактериологического загрязнения водоемов.
• Исследования на базе научных организаций и учебных заведений химического, биологического и медицинского профилей
2. Исследована возможность применения магнитных нанокомпозитных частиц на основе Fe3O4с электроактивным полимерным покрытием в качестве «метки», генерирующей адекватный, чувствительный, легко измеряемый аналитический электрохимический отклик.
3. Показано взаимодействие синтезированных нанокомпозитов всех типов с клетками бактерии E.coli.
4. Разработаны новый электрохимический иммуносенсор и метод определения бактерий (на примере E.coliштамм ATC 25922) с использованием нанокомпозитных частиц Fe3O4- ферроценмодифицированный оксид кремния в качестве метки в диапазоне концентраций 2.3-102 - 2.3-107 КОЕ/мл Предел обнаружения составляет 1.2-101 КОЕ/мл [193].
5. Надежность и правильность результатов определения содержания E.coliв модельных системах и реальных объектах (пробы воды и воздуха) подтверждены сравнением данных полученных с применением разработанного и стандартных методов (бактериального посева и ИФА).
6. Разработан метод электрохимического определения антигенов вирусов (на примере антигена вируса кори) с использованием конъюгатов антител с нанокомпозитными частицами Fe3O4- SiO2в диапазоне концентраций 2.33-10-4 - 2.33 мг/мл. Предел обнаружения составляет 1.87-10-5 мг/мл [194].
Перспективы дальнейшей разработки темы заключаются в проведении испытаний с использованием разработанного электрохимического метода иммуноанализа и сенсора для количественного определения бактерий других видов (помимо Е.соИ}. Уверенность в успешном достижении цели основана на применении оригинальной схемы иммуноанализа, включающей высокоспецифичную иммунореакцию на поверхности сенсора и высокочувствительную электрохимическую детекцию.
Кроме того, будет проведена адаптация разработанного метода и сенсора для определения содержания различных патогенов в реальных объектах (кровь, слюна, испражнения, назальные смывы и др.) с целью аттестации методики количественного определения в сравнении со стандартно-используемыми методами.
Основные исследования по определению вирусных агентов, с использованием синтезированных конъюгатов «антитела - нанокомпозитные частицы» будут направлены на перенос метода с модельных систем на реальные объекты и, также на расширение круга определяемых вирусов.
Таким образом, в дальнейшем разработанные иммуносенсоры и методики определения инфекционных агентов могут быть применены в следующих научных областях:
• Медицинская диагностика: в лечебно-профилактических учреждениях для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний на ранних стадиях.
• Экологический контроль и безопасность жизнедеятельности (учреждения
Роспотребнадзора): мониторинг среды обитания и контроль бактериологического загрязнения водоемов.
• Исследования на базе научных организаций и учебных заведений химического, биологического и медицинского профилей