ВВЕДЕНИЕ 3
ГЛАВА 1. БИОЛОГИЧЕСКАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
БЕЛКА А STAPHYLOCOCCUS AUREUS 5
1.1. Белок А Staphylococcus aureus. Краткая история открытия и изучения белка
А Staphylococcus aureus 5
1.2. Структура белка А Staphylococcus aureus (состав и строение) 7
1.3. Последовательность, кодирующая фрагменты белка А Staphylococcus aureus9
1.4. Аффинная хроматография на белке А Staphylococcus aureus 11
1.5. Конструирование рекомбинантных плазмид 16
1.6. Варианты конструкции рекомбинантного белка А Staphylococcus aureus .... 17
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 21
2.1. Объекты исследования 21
2.2. Материалы исследований 21
2.3. Методы исследований
ВЫВОДЫ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Белок A (англ. protein A) - белок молекулярной массой 40-60 кДа, выделенный с поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus). Роль белка A в патогенезе стафилококковой инфекции заключается в том, что молекулы IgG связываются с поверхностью бактериальных клеток в неправильной ориентации. Это приводит к нарушению опсонизации и фагоцитоза. Белок A связывается с Fc-участком антител, взаимодействуя при этом с тяжёлыми цепями.
Белок A широко используется в молекулярно биологических и биохимических исследованиях, так как специфически связывает многие иммуноглобулины млекопитающих, особенно, иммуноглобулины класса G. Одной из основных областей использования белка А, в настоящее время является аффинная хроматография. Благодаря аффинной хроматографии на белке А, удается получать фармакологически чистые препараты рекомбинантных антител.
Потребность в хроматографических сорбентах с белком А заставили искать альтернативные золотистому стафилококку источник этого белка. В течение двух десятилетий при помощи технологий рекомбинантной ДНК и белковой инженерии были разработаны варианты белка А, обладающие высокой степенью устойчивости к денатурирующим агентам, рН среды и повышенной температуре. Однако ряд проблем связанных с препаратами рекомбинантного белка А остаются не решенными.
Данная работа направлена на синтез новой последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют усеченные полипептиды рекомбинантного белка А, векторы, клетки и способы их применения.
Целью данной работы является проектирование нуклеотидной последовательности обеспечивающей эффективный синтез рекомбинантного белка А Staphylococcus aureus в системе E.coli.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести проектирование экспрессионной кассеты включающей ген инженерного варианта Z-домена белка А Staphylococcus aureus.
2. Провести оптимизацию кодонного состава Z-домена белка А
Staphylococcus aureus для экспрессии в системе E.coli.
3. Провести оптимизацию нуклеотидной последовательности химерного белка включающего Z-домен белка А Staphylococcus aureus для экспрессии в системе E.coli;
4. Провести подбор лидерной последовательности, обеспечивающей экспорт белка в культуральную среду.
Предполагается, что использование набора биоинформатических инструментов позволит разработать плазмидный вектор, обеспечивающий высокоэффективный синтез и секрецию рекомбинантного варианта белка А Staphylococcus aureus.
1. Спроектирована экспрессионная кассета, включающая ген инжинерного варианта Z-домена белка А Staphylococcus aureus при помощи пакета программ SnapGene.
2. Оптимизирован кодонный состав последовательности Z-домена белка А Staphylococcus aureus для экспрессии в системе E.coli при помощи инструмента GeneOptimizer.
3. Усовершенствована первичная последовательность Z-домена белка А Staphylococcus aureus для экспрессии в системе E.coli при помощи инструмента GenScript Rare Codon Analysis Tool
4. Проведено клонирование последовательности Z-gene в составе экспрессионного вектора.
