ВВЕДЕНИЕ 3
ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОФЛОРЫ РИЗОСФЕРЫ .... 5
1.1. Структура ризосферы 5
1.2. Ризосфера сельскохозяйственных культур 8
1.3. Род Bacillus в ризосфере растений 11
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 14
2.1. Материалы исследования 14
2.2. Приготовление питательных сред и реактивов 14
2.3. Методы исследования 15
2.4. Календарный план исследования 19
2.5. Бюджет исследования
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 45
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 46
ПРИЛОЖЕНИЯ 53
В настоящее время большое значение в сельском хозяйстве приобретает применение микробных препаратов для повышения устойчивости к заболеваниям, улучшения роста и питания
сельскохозяйственных культур. Для приготовления этих препаратов используется широкий круг симбиотических ризобактерий, которые в природе создают благоприятные условия для растений, обеспечивая их питательными веществами и защищая от воздействия биотических и абиотических факторов. Обоснованием использования ризосферных бактерий в защите растений от болезней является их нефитотоксичность, значительный удельный вес в почве и в составе обычной микрофлоры растений, эволюционно сложившиеся симбиотические соотношения с растением (Бороздина, 2010).
Для создания микробных биопрепаратов используются преимущественно представители следующих родов: Bacillus, Azospirillum, Flavobacterium, Pseudomonas, Arthrobacter, Agrobacterium (Баубекова, 2014; Муродова, Давранов, 2014). Однако наибольший интерес представляют представители рода Bacillus, а в частности виды Bacillus subtilis, B. toyonensis, B. licheniformis, B. pumilis, как продуценты большого количества различных вторичных метаболитов.
Bacillus - род аэробных грамположительных спорообразующих бактерий, характеризующихся производством биологически активных и антибиотических веществ, а также обладающих способностью фиксировать атмосферный азот (Баубекова, 2014). Данные свойства рода Bacillus делают его наиболее перспективным для создания биологических препаратов, обладающих ценными свойствами. Кроме того способность образовывать эндоспоры является экономически выгодной, так как в такой форме бактерии могут храниться долгое время не теряя своей активности.
Однако род Bacillus характеризуется многообразием природных штаммов, которые выделяют разный набор антибиотических веществ и обладают разной ростостимулирующей активностью. Следовательно, существует постоянная потребность в поиске и выделении новых штаммов, обладающих набором нужных свойств.
В связи с выше изложенным цель настоящей работы: идентификация и изучение морфолого-культуральных свойств бактерий Bacillus sp., выделенных из ризосферы различных растений.
В задачи работы входило:
1. Выделить чистые культуры Bacillus sp. из ризосферы растений.
2. Изучить морфолого-культуральные признаки Bacillus sp.
3. Идентифицировать ризосферные штаммы Bacillus sp. с помощью биохимических тест-систем.
4. Провести генетическую идентификацию ризосферных штаммов Bacillus sp.
Практическая значимость: результаты данного исследования могут быть использованы для разработки биопрепаратов на основе бактерий рода Bacillus для сельского хозяйства.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены и отмечены дипломом за «Лучший доклад» на VI региональной молодежной конференции «Мой выбор — НАУКА!» (Барнаул, 2019).
Выпускная квалификационная работа выполнена в рамках комплексного научного проекта «Разработка биологических препаратов для сельского хозяйства». Все эксперименты, представленные в ВКР, кроме генетической идентификации двух штаммов, выполнены автором лично под руководством А.Н.Иркитовой.
1. Разработана схема выделения и идентификации Bacillus sp. из ризосферы растений.
2. По морфологическим признакам 33 штамма (31%) из 107 образцов ризосферы соответствуют роду Bacillus.
3. Выявлено, что ризосферные штаммы рода Bacillus обладают выраженным полиморфизмом колоний.
4. По биохимическим тестам 8 штаммов (24%) из 33 штаммов были отнесены к роду Bacillus.
5. У 2 штаммов принадлежность к роду Bacillus подтверждена генетической идентификацией.
1. Алексеева А. С., Потатуркина-Нестерова Н. И. Сравнительная характеристика микробиоценоза ризосферы и ризопланы Lycopersicon Esculentum Mill // Современные проблемы науки и образования [Электронный ресурс] - 2014. - № 6. - С. 14-22. URL:http://www.science- education.ru/ru/article/view?id=16597 (30.11.2017).
2. Алесина Н. В. Изучение смены бактериальных компонентов в ризосфере и ризоплане в процессе вегетации растения на примере овса (Avena sativa) // Вестник Московского государственного областного университета. Серия Естественные науки, 2010. - № 1. - С. 5-9.
3. Андреюк Е. И., Антипчук А. Ф. Биорегуляция микробно-растительных систем. - К.: «Н1ЧЛАВА», 2010. - 472 с.
4. Артамонова М. Н., Алексеева А. С., Потатуркина-Нестерова Н. И. Сравнительная характеристика микробоценозов ризосферы представителей семейств Cucurbitaceae и Solanaceae // Естественные и технические науки, 2014. - № 9-10(77). - С. 52-53.
5. Артамонова М. Н., Потатуркина-Нестерова Н. И. Характеристика
микробного сообщества ризосферы и ризопланы Cucurbita pepo L. //
Фундаментальные исследования, 2013. - № 10. - С. 3067-3070.
6. Артамонова М. Н. Ризосферные бактерии Bacillus subtilis и их ростстимулирующее влияние на Cucurbitapepo L. : дис. ... канд. биол. наук. - Ульяновск, 2017. - 181 с.
7. Баубекова Д. Г. Ростстимулирующая активность
микроорганизмов рода ВасШиз // Universum: Химия и биология [Электронный ресурс] - 2014. - № 7(7). - С. 1-7.
URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/1428 (21.02.2018).
8. Безматерных М. А., Сакович Г.С. Физиология и количественный учет микроорганизмов. - Екатеринбург.: ГОУ ВПО УГТУ-УПИ, 2005. - 40 с.
9. Белюченко И. С. Взаимосвязь почвы, растений, микрофлоры и мезофауны в совмещенных посевах // Наука и образование: проблемы и стратегии развития, 2016. - № 1(2). - С. 124-131.
10. Бороздина И. Б. Квантитативные показатели представителей рода
Pseudomonas и Bacillus ризосферы растений семейства бобовые (Fabacaea) и семейства сложноцветные (Compositae) // Вестник Алтайского
государственного аграрного университета, 2010. - № 11(73). - С. 39-43.
11. Васильев Д. А., Калдыркаев А. И., Феоктистова Н. А., Алешкин А. В. Идентификация бактерий Bacillus cereus на основе их фенотипической характеристики. - Ульяновск: НИИЦМиБ УлГСХА им.П. А. Столыпина, 2013. - 98 с.
12. Вечернина Н. А. Практикум по микробиологии. - Барнаул.: Изд- во АлтГУ, 2007. - 80 с.
13. Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) [Электрон. ресурс]. URL:http://www.genetika.ru/vkpm/katalog- mikroorganizmov/.
14. Гажеева Т. П., Гордеева Т. Х, Масленникова С. Н. Динаммика численности и состава микроорганизмов ризосферы некоторых злаковых растений в процессе их роста и развития // Вестник ОГУ, 2011. - № 12. - С. 328-330.
15. Гордеева Т. Х. Формирование микробно-растительных сообществ ризосферы в онтогенезе зерновых культур // Научный журнал КубГАУ, 2012. - № 81(07). - С. 611-620.
16. ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям - Москва, 2016. - 76 с.
17. ГОСТ 10444.1-84 (Межгосударственный стандарт) Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе. - Москва, 2010. - 18 с.
18. ГОСТ 28560-90 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий родов Рго1еиз, Могдапе11а, Ргоухбепсха - Москва, 2010. - 7 с.
19. Добровольская Т. Г. Структура бактериальных сообществ почв. - М.: ИКЦ «Академ-книга», 2002. - 282 с.
20. Еремина И. А., Кригер О. В. Лабораторный практикум по микробиологии. - Кемерово.: КТИПП, 2005. - 112 с.
21. Звягинцев А. Г., Бабьева И. П., Зенова Г. М. Биология почв / Изд. 3-е, испр. и доп. - М.: Издательство Московского университета, 2005. - 448 с.
22. Кравченко Л. В., Шапошников А. И., Макарова Н. М., Азарова Т. С., Львова К. А., Костюк И. И., Ляпунова О. А., Тихонович И. А. Состав корневых экзометаболитов мягкой пшеницы и томата, влияющих на растительно-микробные взаимодействия в ризосфере // Физиология растений, 2011. - Т. 58. - № 5. - С. 781-786.
23. Леонтьевская Е. А. Структура эпифитно-сапротрофных бактериальных комплексов зерновых и овощных культур: дис. ... канд. биол. наук. - Москва, 2014. - 89 с.
24. Максимов И. В., Абизгильдина Р. Р, Пусенкова Л. И. Стимулирующие рост растений микроорганизмы как альтернатива химическим средствам защиты от патогенов (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, 2011. - Т. 47. - № 4. - С. 373-385.
25. Методы почвенной микробиологии и биохимии / под редакцией Д. Г.Звягинцева. — М.: Изд-во МГУ, 1991. - 304 с.
26. Муродова С. С., Давранов К. Д. Комплексные микробные препараты. Применение в сельскохозяйственной практике // Biotechnologia Acta, 2014. - № 6. - С. 92-101.
27. Нетрусов А. И., Егорова М. А., Захарчук Л. М., Колотилова Н. Н. Котова И. Б. Практикум по микробиологии. - М.: Академия, 2005. — 608 с.
28. Пищик В. Н., Воробьев Н. И., Проворов Н. А., Хомяков Ю. В.
Механизмы адаптации растений и микроорганизмов в растительно-микробных системах к тяжелым металлам // Микробиология, 2016. - Т. 85.
- № 3. - С. 231-247.
29. ОФС.1.2.4.0002.15 Микробиологическая чистота. Общая фармакопейная статья. Г осударственная Фармакопея Российской Федерации, XIII изд. - Москва, 2015. - Т. 2. - 1004 с.
30. ОФС.1.7.2.0012.15 Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков. Общая фармакопейная статья. Государственная Фармакопея Российской Федерации, XIII изд. - Москва, 2015. - Т. 1. - 1470 с.
31. Прунтов О. В., Сахно О. Н. Лабораторный практикум по общей микробиологии. - Владимир.: ВлГУ, 2005. - 76 с.
32. Романычева А. А. Сравнительная оценка микробоценоза почв в ризосфере Zea mays в условиях монокультуры и в севообороте на разных агрохимических фонах: дис. ... канд. биол. наук. - Москва, 2014. - 128 с.
33. Садунова А. В. Общая характеристика бактерий рода Bacillus. - Владивосток: Дальневосточный федеральный университет, 2014. - 66 с.
34. Снисаренко Т. А., Алесина Н. В. Влияние некоторых экологических факторов на микробный состав ризосферы и ризопланы на примере овса посевного (Avena sativa) // Вестник Московского государственного областного университета, 2014. - № 3. - С. 46-51.
35. Соколова М. Г., Белоголова Г. А., Акимова Г. П., Вайшля О. Б. Влияние инокуляции ризосферными бактериями на рост растений и транслокацию микроэлементов из загрязненных почв // Агрохимия, 2016. - № 7. - С. 72-80.
36. Соколова М. Г., Белоголова Г. А., Гордеева О. Н., Акимова Г. П. Влияние ризосферных бактерий на рост растений и накопление ими тяжелых металлов на техногенно загрязненных почвах // Агрохимия, 2014. - № 2. - С. 73-80.
37. Соколова Т. А. Специфика свойств почв в ризосфере: анализ литературы // Почвоведение, 2015 - № 9 - С. 1097-1111.
38. Феоктистова Н. В., Марданова А. М., Хадиева Г. Ф., Шарипова М. Р. Ризосферные бактерии // Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки, 2016. - № 2. - С. 207-224.
39. Чеботарь В. К., Завалин А. А., Кипрушкина Е. Н. Эффективность применения биопрепарата экстрасол. - М.: Издательство ВНИИА, 2007. - 230с.
40. Чудинова Ю. В. Корневые выделения льна: влияние на продукционный процесс и состав микроорганизмов ризосферы // Вестник Красноярского государственного аграрного университета, 2007. - № 5. - С. 58-61.
41. Чудинова Ю. В. Характеристика растительно-микробного сообщества ризосферы сорта льна Томской селекции Т-16 в льноводческих хозяйствах Томской области // Вестник Томского государственного университета, 2007. - № 300. - С. 249-251.
42. Широких, И. Г., Мерзаева О. В., Зенова Г. М. Изменение структуры ризосферного комплекса актиномицетов в онтогенезе озимой ржи // Почвоведение, 2006. - № 6. - С. 721-725.
43. Широких А. А., Мерзаева О. В. Методические подходы к изучению микроорганизмов прикорневой зоны растений // Сельскохозяйственная биология, 2007. - № 1. - С. 43-55.
44. Berg G. Plant-microbe interactions promoting plant growth and health: perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture // Applied and Environmental Microbiology, 2009. - V.84. - P. 11-18.
45. Bulgarelli D., Schlaeppi K., Spaepen S., Schulze-Lefert P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants // Annual Review of Plant Biology, 2013. - № 64. - Р. 807-838.
46. Choudhary D. K., Johri B. N. Interactions of Bacillus spp. and plants - with special refer-ence to induced systemic resistance (ISR) // Microbiol. Res., 2009. - V. 164. - № 5. - P. 493-513.
47. Conn V. M., Franco C. M. M. Analysis of the endophytic actinobacterial population in the roots of wheat (Triticum aestivum L.) by terminal restriction fragment length polymorphism and sequencing of 16S rRNA clones. Applied and Environmental Microbiology, 2004. - V. 70. - P. 1787-1794.
48. De Vos P, Garrity G, Jones D, et al. Bergey’s manual of systematic bacteriology, vol. 3. Springer - New York, 2009. - 1422 р.
49. Figueiredo, M. V. B., Seldin, L., Araujo, F. F., Mariano, R. L. R. Plant growth promoting rhizobacteria: fundamentals and applications // Plant growth and health promoting bacteria, 2010. - № 18. - Р. 21-43.
50. Glick B. R. Plant growth-promoting bacteria: mechanisms and applications // Scientifica, 2012. URL: http://dx.doi.org/10.6064/2012/963401.
51. Kumar Р., Khare S., Dubey R. C. Diversity of Bacilli from Disease Suppressive Soil and their Role in Plant Growth Promotion and Yield Enhancement // New York Science Journal, 2012. - № 5(1). - Р. 90-111.
52. McNear Jr. D. H. The rhizosphere -roots, soil and everything in between // Nat. Educ. Knowl, 2013. - V. 4 - № 3. -P. 1-16.
53. Rosenblueth M., Martinez-Romero E. Bacterial endophytes and their interactions with hosts // Molecular Plant-Microbe Interactions, 2006. - V. 19. - № 8. - P. 827-837.
54. Saito A., Ikeda S., Ezura H., Minamisawa K. Microbial Community Analysis of the Phytosphere Using Culture-Independent Methodologies // Microbes Inviron, 2007. - V. 22. - № 2. - P. 93-105.
55. Sanchez-Contreras M., Bauer W. D., Gao M. Quorum-sensing regulation in rhizobia and its role in symbiotic interactions with legumes // Philosophical Transactions of the Royal Society B, 2007. - № 362. - P. 1149-1163.
56. Sgroy V., Cassan F., Masciarelli O., Del Papa M. F., Lagares A., Luna V. Isolation and characterization of endophytic plant growth-promoting (PGPB) or stress homeostasis-regulating (PSHB) bacteria associated to the halophyte Prosopis strombulifera // Applied Microbiology and Biotechnology, 2009. - V. 85.
- № 2. - P. 371-381.
57. Slepecky R. A., Hemphill H. T. The Genus Bacillus-Nonmedical // Prokaryotes, 2006. - № 4. - Р. 530-562.