Список сокращений 5
Реферат 7
Введение 8
1 Теоретическая часть 10
1.1 Репарация 10
1.2 Белок Ku70/80 13
1.3 Экспрессионная система P. pastoris 17
2 Методики и материалы 21
2.1 Выделение мРНК из лимфоцитов 24
2.2 Полимеразная цепная реакция 25
2.3 Проведение гидролиза ДНК рестриктазами 25
2.4 Дефосфорилирование термолабильной щелочной фосфатазой 26
2.5 Электрофорез 26
2.6 Лигирование 27
2.7 Очистка ДНК из геля 28
2.8 Трансформация 29
2.9 Выделение плазмидной ДНК на наборе QIAprep Spin Miniprep Kit 29
2.10 Амплификация клонов 30
2.11 Подготовка компетентных клеток NEB Stable 31
2.12 Наработка ДНК и выделение плазмидной ДНК на наборе CompactPrep Plasmid
Maxi Kit 31
2.13 Выделение ДНК из геля 33
2.14 Техника безопасности 33
2.14.1 Общие правила техники безопасности при работе в химической лаборатории 33
2.14.2 Техника безопасности в микробиологической лаборатории 35
2.14.3 Техника безопасности при работе реактивами, используемыми в работе ... 36
3 Обсуждение результатов 38
Выводы 45
Библиографический список 46
Дезоксирибонуклеиновая кислота является одной из трех (помимо рибонуклеиновой кислоты и белков) важнейших макромолекул для организма. ДНК обеспечивает хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Также она содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков. Самая большая опасность для ДНК, грозящая жизнеспособности клетки, - двухцепочечные разрывы, которые возникают при действии ионизирующего излучения и могут привести к мутации и даже гибели клетки.
Существует два основных механизма репарации двухцепочечных разрывов: гомологичная рекомбинация и негомологичное соединение концов. В клетках высших эукариотических организмов преобладает второй механизм. Для данного механизма репарации необходим белок Ku, функционирующий как молекулярный остов, к которому прикрепляются другие белки, принимающие участие в процессе репарации [1].
Содержание белка Ku может иметь большое значение для функционирования раковых клеток. Если этого белка много, то процессы репарации ДНК будут усилены, что может увеличить устойчивость раковых клеток к ионизирующему излучению и сделать терапию неэффективной. В связи с этим большой интерес представляют методы, при помощи которых становится возможным снижение активности репарации опухолевых клеток. Конечно, для этого необходимо доскональное изучение механизма репарации, чтобы минимизировать возможность причинения вреда организму [2].
Для изучения белка Ku и его роли в различных процессах необходимо сначала получить его рекомбинантный аналог, который можно будет использовать в экспериментах. Дрожжевая экспрессионная система Pichia pastoris обладает рядом преимуществ перед классической системой E. coli, в частности из-за наличия системы пострансляционной модификации (в первую очередь гликозилирование), отсутствующей у бактерий.
Целью данной работы является конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих гены белков Ku70 и Ku80.
Задачи:
1. На основании литературного обзора выбрать систему экспрессии белков Ku70 и Ku80.
2. Амплифицировать гены XRCC6 и XRCC5 на матрице мРНК клеточной линии HEK-293T.
3. Клонировать гены XRCC6 и XRCC5 в составе вектора pJet1.2.
4. Клонировать гены XRCC6 и XRCC5 в составе экспрессирующего вектора pPICZ aB.
5. Собрать экспрессионную кассету, кодирующую белки Ku70/80.
В работе использованы генно-инженерные методы для создания плазмид и биотехнологические методы культивирования биообъектов.
1. В результате проведения литературного обзора в качестве системы экспрессии были выбраны метилотрофные дрожжи P. pastoris.
2. Из клеточной линии HEK-293 была выделена мРНК, на основе которой при помощи ОТ-ПЦР были получены последовательности кодирующих областей генов XRCC5 и XRCC6.
3. В клонирующий вектор pJet1.2 осуществлена встройка кодирующих областей генов XRCC5 и XRCC6.
4. Сконструированы рекомбинантные плазмиды pPICZ aB+Ku70 и pPICZ aB+Ku80, включающие последовательности кодирующих областей генов XRCC6 и XRCC5.
5. Сконструирована экспрессионная кассета, содержащая последовательности кодирующих областей генов XRCC5 и XRCC6 для их одновременной экспрессии.
