Разработка рекомбинантного вектора для экспрессии гибридной липазы в Kluyveromyces lactis

Список сокращений 7
Введение 8
Глава 1. Общая характеристика липаз и фосфолипаз 10
1.1 Липазы 10
1.2 Фосфолипазы 15
1.3 Структурные особенности и каталитический механизм липаз 25
1.4 Структурные особенности и каталитический механизм фосфолипаз .... 30
1.5 . Источник липаз и фосфолипаз 34
1.5.1 Животные источники 34
1.5.2 Растительные источники 34
1.5.3 Микробные источники 35
1.5.4 Рекомбинантные липазы и фосфолипазы 36
1.6. Промышленное применение липаз и фосфолипаз 39
1.6.1 Практическое применение липаз 39
1.6.2 Применение фосфолипаз в промышленности 41
Глава 2 Материалы и методы 44
2.1 Материалы 44
2.1.1 Бактериальные штаммы и плазмиды 44
2.1.2 Нуклеотидные последовательности 44
2.1.3 Ферменты и буферы 45
2.1.4 Питательные среды и антибиотики 45
2.1.5 Реактивы 46
2.1.6 Буферы и растворы 47
2.2 Методы 49
Молекулярно-генетические методы, используемые для получения рекомбинантных белков 49
2.2.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 49
2.2.2 Гидролиз ДНК 49
2.2.3 Аналитический электрофорез в агарозном гели 49...
Купить

Липазы и фосфолипазы являются ферментами класса гидролаз, которые расщепляют гидрофобные эфирные связи триацилглицеринов и фосфолипидов, соответственно [1]. Субстратом для липаз может выступать широкий спектр жирорастворимых соединений (алифатические, алициклические, бициклические и ароматические сложные эфиры, тиоэфиры, активированные амины) [2]. Специфическим субстратом для всех фосфолипаз является фосфатидилхолин. Однако они могут действовать также на фосфатидилэтаноламин (PE), фосфатидилинозитол (PI), сфингомиелин, лизофосфатидилхолин (LPC), лизофасфатидилинозитол (LPI) в некоторых организмах и тканях [3].
Липолитические ферменты широко представлены в живой природе (животных, растений, дрожжей, грибов и бактерий) [1]. У высших эукариот липазы, как правило, локализованы внутри определенных органелл (например, лизосомы), однако их можно найти во внеклеточном пространстве, они также играют роль в метаболизме, абсорбции и переносе липидов. У низших эукариот и бактерий липазы могут быть как внутриклеточными, так и секретируемыми (обеспечивают деградацию липидных субстратов, присутствующие в окружающей среде). В некоторых патогенных организмах (Candida albicans, Staphylococcus и Pseudomonas species, Helicobacter pylori) они могут даже действовать как факторы вирулентности [4]. Группа ферментов фосфолипаз имеет важное физиологическое значение. У эукариот, фосфолипазы участвуют в некоторых стадиях липидного обмена, таких как переваривания жиров, восстановления метаболизма липопротеинов и т.д. Фосфолипазы также инициируют сигнальный каскад трансдукции в ответ на активацию рецепторов клеточной поверхности и действуют в качестве липидных вторичных посредников [3, 5]. В микроорганизмах фосфолипазы также как и липазы играют определенную роль как фактор вирулентности. Разрушение фосфолипазами патогенных бактерий, грибов фосфолипидов и последующее изменение компонентов клеточных мембран приводит к повреждению клеток, зачастую это является механизмом вирулентности [6].
Разнообразие в происхождении, клеточной локализации и функциях отражается в удивительной степени биохимической изменчивости, поскольку липазы и фосфолипазы из разных организмов или даже их изоферменты, произведенные одним и тем же организмом, могут сильно различаться по молекулярной массе, рН и температурным оптимумам, посттрансляционным модификациям, субстрату и специфичностью реакции. Это имеет большое значение для биотехнологии как потенциального источника биокатализаторов, обладающих широким спектром оптимумов и особенностей, которые могут адаптироваться к различным условиям процесса. Таким образом, липазы и фосфолипазы представляют собой перспективную группу биокатализаторов, которые уже широко используются в различных промышленных применениях, таких как производство биодизеля, продуктов питания, биологически активных добавок, моющих средств, косметики, также принимают участие в гидратации масел, и в бумажной промышленности. Методы рационального дизайна а так же случайный мутагенез могут способствовать улучшению свойств липаз и фосфолипаз и способствовать более широкому использованию этих ферментов в хозяйственной деятельности [1].
Цель данной работы: разработка рекомбинантного вектора для экспрессии гибридной липазы в Kluyveromyces lactis .
Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Провести дизайн гена кодирующего гибридную липазу;
2. Подобрать экспрессинную систему и вектора;
3. Провести клонирование гибридного гена липазы в составе сконструированного вектора;
4. Провести анализ синтеза рекомбинантного белка.
Купить