ВВЕДЕНИЕ 3
ГЛАВА 1. ПРОИЗВОДСТВО ПРОДУКТОВ ВТОРИЧНОГО
МЕТАБОЛИЗМА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ 5
1.1. Вторичные метаболиты клеточных культур растений 5
1.2. Пути увеличения производства вторичных метаболитов 9
1.2.1. Отбор по молекулярным и генетическим характеристикам.. 10
1.2.2. Оптимизация питательной среды и условий
культивирования 13
1.2.2.1. Химические компоненты 14
1.2.2.2. Физические факторы 19
1.2.3. Направленный метаболизм 20
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 25
2.1. Объект исследования 25
2.2. Методы исследования 28
ГЛАВА 3. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ
ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КОРНЕЙ TAGETES PA TULA L 33
3.1. Оценка способов проведения трансформации объекта 33
3.1.1. Инокуляция стерильных проростков 34
3.1.2. Инокуляция изолированных растительных эксплантов 36
3.2. Получение первичной асептической ризогенной культуры 38
3.2.1. Оптимизация времени совместного культивирования
эксплантов и бактериальной суспензии 38
3.2.2. Определение углеводного состава питательной среды 40
3.2.3. Оценка вирулентности штаммов Agrobacterium rhizogenes.. 42
ВЫВОДЫ 48
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 49
Растительные клетки способны синтезировать свыше 200 тысяч различных веществ вторичного происхождения, относящихся к разным классам химических соединений (Полетаева, Александрова, Краснов, 1984; Бутенко, 1999; Hartmann, 2007). Вторичные метаболиты растений, по большей части, играют экологическую роль как аттрактанты для насекомых или в защитных механизмах против хищников. Однако они чрезвычайно востребованы при производстве новых лекарственных препаратов (Ким, 1999; Саратиков, Краснов, 2004; Grech-Baran, Syklowska-Baranek, Krajewska- Patan et al., 2014; Куркин, 2013, 2015; Болденков, Лобанова, 2016). Эти соединения могут быть непосредственно использованы в качестве лекарственных средств без каких-либо изменений или подвержены дальнейшей переработке для получения конечного препарата (Stafford, Morris, Fowler, 1986; Сацыперова, Паутова, Куркин и др., 1994; Лафон, 1998; Степанова, Ширзад, Евсеева, 2016).
Было установлено, что культуры клеток растений in vitro способны синтезировать практически все классы вторичных метаболитов (Karuppusamy, 2009; Хапилина, Купешев, Данилова и др., 2015). Однако они не достаточно продуктивны и зачастую нерентабельны при использовании в промышленных масштабах. В условиях in vitro растительную биомассу возможно наращивать в виде дифференцированных культур (Олина, Орлова, Степанова, 2016), которые получили название «бородатые» корни» или «hairy roots» (Лешина, 2011).
Получение корневых культур возможно путем трансформации растительных клеток, в результате которой образуется масса адвентивных корней, позволяющих получить хорошо растущую корневую культуру, не требующих экзогенных веществ. Рост такой культуры инициируется поранением растительной ткани и переносом фрагмента ДНК ^i-плазмиды почвенной бактерии Agrobacterium rhizogenes в клеточный геном, что вызывает изменение гормонального состава клетки и инициирует появление корнеподобных образований (Tanaka, Takao, Matsumoto, 1994).
Корневые культуры неограниченно и быстро растут на безгормональных питательных средах, обладают генетической и биохимической стабильностью. Технология позволяет получать экологически чистое сырье без ущерба для окружающей среды (Hayta et al., 2011). Генетическая трансформация Agrobacterium rhizogenes является эффективным методом увеличения накопления вторичных метаболитов в растительных клетках (Кулуев, Вершинина, Князев и др., 2015).
Целью исследования явилась оптимизация отдельных этапов технологии получения в культуре in vitro генетически трансформированных корней Tagetes patula L.
В задачи исследования входило:
1) подобрать наиболее эффективный способ инокуляции in vitro стерильных эксплантов Т. patula почвенными агробактериями;
2) оптимизировать время совместного культивирования эксплантов и агробактериальной суспензии и углеводный состав питательной среды для получения первичной ризогенной культуры Т. patula;
3) провести оценку вирулентности различных штаммов A. rhizogenes и определить оптимальный штамм для получения стабильно растущей культуры hairy roots.
1. Эффективным способом генетической трансформации Tagetes patula L. является совместное культивирование in vitro стерильных листовых эксплантов с разбавленной в питательной среде Мурасиге-Скуга суспензией бактерий Agrobacterium rhizogenes.
2. Время совместного культивирования эксплантов T. patula и
агробактериальной суспензии, обеспечивающее эффективную
трансформацию, составляет 24 часа с последующим переводом на среду МС, содержащую 20-25 г/л сахарозы.
3. Наиболее продуктивным штаммом A. rhizogenes для получения стабильно растущей культуры hairy roots T. patula является дикий штамм 8196RT.
4. В результате генетической трансформации листовых эксплантов T. patula получены стабильно растущие in vitro корневые культуры.
