Список сокращений 3
Введение 4
ГЛАВА 1. КЛАСТЕРЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И ИХ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ... 6
1.1. Т-клеточный иммунный ответ 6
1.2. СО-рецепторы 8
1.3. Семейство И7-2 11
1.4. Методы исследования белок-белковых взаимодействий 15
1.4.1. Метод фагового дисплея 16
1.4.2. Пептидные микрочипы 17
1.4.3. Рентгеноструктурный анализ белковых комплексов 19
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 22
2.1. Материалы исследования 22
2.2. Методы исследования 24
2.3. Календарный план исследования 31
2.4. Бюджет исследования 32
ГЛАВА 3. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ, БЛОКИРУЮЩИЕ B7-2 35
3.1. Отбор специфических пептидов 35
3.2. Идентификация аминокислотных последовательностей 38
3.3. Анализ иммунохимических свойств отобранных пептидов 39
ВЫВОДЫ 44
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 45
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 46
По данным Росстата на 2018 год рак занимает второе место по смертности населения. Из-за устойчивости к лекарствам, отсутствия опухолевой избирательности, разработанные методы лечения рака утратили терапевтический эффект. В связи с этим, необходим поиск новых терапевтических и диагностических агентов (Marqus, Pirogova, Piva, 2017).
В качестве основы для разработки эффективных средств терапии онкологических заболеваний выступают пептиды, характеризующиеся высокой специфичностью взаимодействия с мишенью. Важной особенностью использования пептидов является отсутствие накопления их в органах, например, почках или печени, что снижает уровень токсического эффекта (Titov, 2013).
В настоящее время технология фагового дисплея является одним из методов поиска новых пептидных лигандов. Фаговые пептидные библиотеки являются источником получения пептидов, которые способны избирательно взаимодействовать с белками, липидами, углеводами (Urban, Mosmajer, Bosma, 2019). Важным преимуществом метода является возможность определения аминокислотной последовательности пептида по кодирующей его ДНК. Для отобранных пептидов проводится аффинная селекция с целью получения высокоспецифичных пептидных лигандов. Путем секвенирования ДНК отобранных клонов, определяется первичная структура пептида.
Пептиды, которые обладают высокой аффинностью и лишены токсичности и иммуногенности, являются основой для разработки средств, регулирующих иммунный ответ, а также создания эффективных лекарственных веществ.
Цель исследования - отобрать пептиды, блокирующие ко- регуляторный белок B7-2, с помощью аффинной селекции.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Отобрать пептиды, используя фаговую пептидную библиотеку GerLab;
2. Определить нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислоты пептидов отобранных клонов секвенированием по Сэнгеру;
3. Провести биоинформатический анализ полученных последовательностей с помощью программы BioEdit.
4. Проанализировать иммунохимические свойства отобранных пептидов методами ИФА и дот-блот анализа.
Практическая значимость: результаты данного исследования могут быть использованы для дальнейшего изучения иммунного ответа и разработки иммунотерапевтических средств против раковых заболеваний.
1. Титр бактериофагов, отобранных после трех раундов аффинной селекции фаговой пептидной библиотеки против ко-регуляторной молекулы В7-2, составил 1010, 1011, 109 соответственно. Концентрация выделенной из бактериофагов одноцепочечной ДНК составила примерно 90 нг/мкл;
2. Определены нуклеотидные последовательности 9 фаговых клонов в области встройки чужеродных пептидов;
3. На основе компьютерного анализа выявлены 2 группы пептидов. Первая группа, представленная единичными клонами, не имеет между собой общего аминокислотного мотива в составе, экспонируемого пептиды CPSASSQLTC,
QMPALMQQ, AHIEVVSP. Вторая группа представлена клонами бактериофагов, несущих одну аминокислотную последовательность CLARCLGRC;
4. На основе результатов иммунохимического анализа показано, что максимальным сродством к молекуле В7-2 обладает пептид второй группы бактериофагов состава CLARCLGRC.
