Двумерные гетерокорреляционные ЯМР эксперименты и анализ величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия в определении структуры бета-амилоида в растворе
Болезнь Альцгеймера (также сенильная деменция альцгеймеровского типа) – на данный момент, неизлечимое нейродегенеративное заболевание, впервые описанное в 1906 году немецким психиатром Алоисом Альцгеймером. Как правило, она обнаруживается у людей старше 65 лет, но существует и ранняя болезнь Альцгеймера – редкая форма заболевания. Общемировая заболеваемость на 2006 год оценивалась в 26.6 млн человек, а к 2050 году число больных может вырасти вчетверо.
В настоящее время не достигнуто полного понимания причин болезни Альцгеймера. Исследования говорят об ассоциации болезни с накоплением бляшек и нейрофибриллярных клубков в тканях мозга [1].
В 1991 году была предложена «амилоидная гипотеза», согласно которой базовой причиной заболевания являются отложения бета-амилоида (Aβ) (рисунок 1). Ген, кодирующий белок (APP), из которого образуется бета-амилоид, расположен на 21 хромосоме. Установлено, что болезнь Альцгеймера является протеинопатией – заболеванием, связанным с накоплением в тканях мозга ненормально свёрнутых белков – бета-амилоида и тау-белка [2]. Бляшки образуются из малых пептидов длиной в 39-43 аминокислоты, именуемых бета-амилоидами (A-beta, Aβ). Бета-амилоид является фрагментом более крупного белка-предшественника – APP [3, 4]. Этот трансмембранный белок играет важную роль в росте нейрона, его выживании и восстановлении после повреждений. При болезни Альцгеймера, по неизвестным пока причинам, APP подвергается протеолизу – разделяется на пептиды под воздействием ферментов. Бета-амилоидные нити, образованные одним из пептидов, слипаются в межклеточном пространстве в плотные образования, известные как сенильные бляшки [5].
Интересным фактом в поддержку амилоидной гипотезы является то, что практически у всех доживших до 40 лет людей, страдающих синдромом Дауна (дополнительная копия 21 хромосомы либо ее участка), обнаруживается Альцгеймер-подобная патология [6, 7]. К тому же APOE4, основной генетический фактор риска болезни Альцгеймера, приводит к избыточному накоплению амилоида в тканях мозга ещё до наступления симптомов [8]. Более того, у трансгенных мышей, в организме которых вырабатывается мутантная форма человеческого гена APP, в мозге происходит отложение фибриллярных амилоидных бляшек и отмечаются другие патологические признаки, свойственные болезни Альцгеймера.
В рамках данной работы был исследован бета-амилоид Aβ13-23 (рисунок 2), который является фрагментом бета-амилоида Aβ1-40 (рисунок 1). Предполагается, что данный фрагмент содержит центр агрегации бета- амилоидов, к тому же на участке с 13 по 23 аминокислотный остаток наблюдалось наличие вторичной структуры в виде 310 спирали для бета- амилоида в растворе Aβ1-40 [9-11]. Конформация пептида в виде 310 спирали является менее энергетически выгодной, чем например, в виде α-спирали, по этой причине, представляет интерес более детальное изучение пространственной структуры центрального фрагмента бета-амилоида Aβ1-40 с 13 по 23 аминокислотный остаток. Этим обусловлена актуальность и практическая значимость работы.
Для экспериментов по установлению пространственной структуры необходимо произвести отнесение сигналов в спектрах ЯМР 1H и 13С. Поэтому, была поставлена задача провести ряд двумерных корреляционных экспериментов для отнесения сигналов в спектрах ЯМР.
Бета-амилоид был растворен в 20 мМ фосфатном буфере (90% H2O + 10% D2O) при pH = 7.3 и T = 293°K,а также в ориентированной жидкокристаллической среде (n-алкин-поли(этилен)гликоля (С12E5, где 12 – число атомов углерода в n-алкильной группе и 5 – число единиц гликоля в поли-этилен гликоле) чистота ≥98%, Sigma), нормального спирта (гексанол) и исходного буферного раствора). Отнесение сигналов в спектрах ЯМР на ядрах 1H и 13С проводилось по методике совместного использования TOCSY и HSQC экспериментов, методом RDC. Обработка измерений проводилась на программе Sparky, структуры были рассчитаны на программе Xplore. Было рассчитано 100 структур. С помощью программы Mol-Mol осуществлено построение структуры, выбрано 23 структуры с минимальной энергией. [12].
Работа выполнена в ЯМР лаборатории Института физики на ЯМР спектрометре AVANCE-500 (Bruker) с частотой 500 МГц по ядрам 1H.
Бета-амилоид Aβ13-23 был синтезирован в лаборатории пептидного синтеза, отделения химии поверхностных явлений, технического университета Лулео под руководством доктора физико-математических наук Филиппова А.В. (Luleå University of Technology, Luleå, SE-91187, Sweden).
С помощью двумерных гомо- и гетероядерных (1H-1H и 1H-13С) экспериментов ЯМР произведено отнесение сигналов в спектрах, получены данные о химических сдвигах ядер для Аβ13-23 в растворе.
На основе экспериментально определенных значений констант остаточного диполь-дипольного взаимодействия была рассчитана пространственная структура бета-амилоида Аβ13-23 в растворе.
Установлено, что в растворе пептид Аβ13-23 не имеет конформации в виде вторичной структуры (спирали или складки).
Установленные спектральные параметры ЯМР и измеренные межпротонные расстояния могут быть использованы в дальнейшем при изучении больших по размеру амилоидов. Координаты атомов (в pdb формате), определенные путем анализа экспериментальных значений констант остаточного ДДВ могут быть использованы при сравнении с координатами атомов аналогичных аминокислотных последовательностей (в частном случае фрагментов цепей полипептидов).
