Введение 4
Обзор литературы 6
О раке предстательной железы 6
О микроокружении ткани опухоли 10
Метод циклической иммунофлуоресценции CyCIF 13
Другие методы комплексного исследования тканей 19
Подходы к автоматической сегментации клеток 22
Применение конволюционных нейронных сетей в решении задачи сегментации 23
Материалы и методы 25
Результаты 34
Обсуждение 49
Выводы 50
Список литературы
Онкологические заболевания - одна из наиболее частых причин смерти в мире. По данным Всемирной организаций здравоохранения, рак занимает вторую позицию в списке лидирующих причин смертности, уступая только сердечно-сосудистым заболеваниям.1 Каждая шестая смерть в мире происходит в следствие опухолевого процесса. При этом разные виды рака отличаются по частоте выявления и опасности для жизни человека. Согласно информации из базы данных GLOBOCAN, на 2018 год, исследуемый в данной работе рак простаты является вторым по частоте диагностирования у мужчин среди всех онкологических заболеваний (13,5% случаев) после рака лёгких (14,5 % случаев).2
Необходимо отметить, что существует тенденция ежегодного увеличения диагностируемых случаев онкологических заболеваний.3-5 Таким образом, в настоящее время перед обществом особенно остро стоит проблема их выявления и лечения.
Существует большое количество методов исследования тканей опухоли и способов лечения этих заболеваний. Новые методы лечения, такие как таргетная и иммунная терапия, являются следствием значительного научного прогресса в понимании молекулярных механизмов канцерогенеза и разнообразных клеточных взаимодействий в области опухолевого микроокружения. Для определения клеточного состава ткани и внутриклеточной экспрессии различных молекулярных компонент, в современной диагностической практике одним из наиболее популярных является метод проточной цитометрии6. Однако, данный метод, как и многие другие лабораторные методы, в которых происходит разрушение структуры самой ткани, позволяет оценить клеточный состав лишь количественно, не давая информации об архитектуре опухоли и расположении клеток относительно друг друга. Возможность достаточно быстро и качественно получать такую информацию из образца открывает большое поле для научных исследований и потенциально может сыграть важную роль в развитии медицины. Принятый в медицинской практике метод иммуногистохимии (IHC) используется в основном для визуализации небольшого набора маркеров на слайде. Сложность задачи визуализации достаточного набора маркеров для определения местоположения и типов клеток в образце связана с техническими ограничениями для одновременной визуализации разных маркеров, длительным процессом окрашивания, риском разрушения образца в процессе работы, а также необходимостью в разработке и применении алгоритмов машинного обучения для быстрой и качественной обработки полученных изображений и идентификации клеточных контуров.
В последние годы появляются новые методы иммуногистохимических исследований, позволяющие визуализировать до 60 маркеров на одном слайде. В данной работе будут исследованы возможности одного из методов MxIF (Multiplexed Immunofluorescence) - циклической иммунофлуоресценции (CyCIF)7-9, на примере 15 образцов аденокарциномы предстательной железы и представлен способ обработки и анализа флуоресцентных изображений ткани при помощи машинного обучения.
При диагностике рака простаты и наблюдении за течением этого заболевания используется метод mpMRI10,11, который безопаснее регулярного проведения биопсии, так как было показано, что частый забор биологического материала может способствовать развитию воспаления у больного. Такой побочный эффект наблюдался у 1-4% пациентов.12 Важно отметить, что MRI не всегда позволяет выявить злокачественное разрастание ткани простаты. Так, в работе 2019 года13 было показано, что 23 из 89 пациентов получило ложно-отрицательное заключение на основании МРТ-исследования, при этом 17.4% из них имели средний и высокий риск в соответствии с Decipher Genomic Classifier.14 Это же подтверждается рядом других исследований, которые своей целью ставили определение факторов, влияющих на видимость злокачественного образования при mpMRI.15,16
Целями данной работы являлись изучение возможностей метода MxIF при исследовании образцов аденокарциномы предстательной железы и поиск критериев, позволяющих определить различие в образцах, определяемых (MRI-visible) и не определяемых (MRI-invisible) как опухолевые по результатам mpMRI.
Задачи для реализации поставленной цели включали в себя:
• решить задачу сегментации клеток на основе изображений,
полученных методом мультиплексной иммунофлуоресценции;
• определить клеточные типы на основании классификации по экспрессии имеющихся маркеров;
• проанализировать взаимное расположение клеток на срезах;
• реализовать метрики сравнения опухолевого и не злокачественного эпителия, а также стромального микроокружения опухоли в тканях MRI-visible и MRI-invisible пациентов.
В данной работе был проведен анализ флуоресцентных изображений, полученных методом циклической иммунофлуоресценции для изучения возможностей исследования тканей без нарушения их архитектуры:
1. Обучена нейронная сеть для выделения клеточных контуров на изображениях;
2. Выделены 9 клеточных типов на основании интенсивности свечения имеющихся маркеров;
3. Проанализировано взаимное расположение клеток на слайдах гистологических препаратов аденокарциномы предстательной железы;
4. Проведено сравнение плотностей распределения клеток в разных регионах опухоли для двух групп пациентов, сформированных на основании результатов МРТ-диагностики. Статистически значимых отличий получено не было;
5. Проведен анализ групп клеточных соседств, выделено 10 групп. Статистически значимых отличий по пропорциям этих групп для пациентов с определяемым и не определяемым по МРТ диагнозом не обнаружено;
6. Проведено вычисление различий между распределениями стромы в зонах опухоли и зонах без видимых злокачественных изменений с помощью метрики Вассерштайна для каждого пациента когорты. Для двух исследуемых групп пациентов получено p-value = 0.7 при сравнении по этому параметру;
7. Существенное различие между двумя группами получено по критерию среднего количества опухолевых соседей у опухолевой клетки эпителия в ацинусах с видимыми изменениями морфологии относительно неопухолевой ткани (p-value = 0.06).
