ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННОГО ИНСУЛИН-ПОДОБНОГО ФАКТОРА РОСТА (IGF-LR3)
|
Введение
1. Аналитический обзор 10
1.1. Характеристика IGF 1 10
1.2. Характеристика IGF-LR3 11
1.2.1. Перспективы применения IGF-LR3 11
1.3. Обзор заболеваний, связанных с нарушением роста 12
1.4. Препараты на основе инсулин-подобного фактора роста 1 13
1.5. Основные этапы разработки генотерапевтического препарата 14
1.5.1. Подготовительный этап 15
1.5.2. Выбор терапевтического гена 15
1.5.3. Выбор пути введения 15
1.5.4. Подбор системы доставки гена 16
1.5.5. Обеспечение клеточной специфичности (клеточный таргетинг) 17
1.5.6. Экспрессия доставленного гена в клетках млекопитающих и человека 17
1.6. Системы доставки терапевтического гена 18
1.7. Классификация невирусных методов доставки 19
1.7.1 Физические методы доставки 19
1.7.1.1. Микроинъекция 19
1.7.1.2. Биобаллистика ДНК 19
1.7.1.3. Электропорация 20
1.7.1.4. Сонопорация 21
1.7.1.5. Фотопорация 22
1.7.1.6. Магнитофекция 22
1.7.1.7. Гидропорация 22
1.7.2 Химические методы доставки 23
1.7.2.1 Неорганические частицы 23
1.7.2.2. Синтетические и натуральные биоразлагаемые носители 24
1.8. Классификация вирусных методов доставки 25
1.8.1. Аденовирусные векторы 26
1.8.2. Аденоассоциированные вирусные векторы 26
1.8.3. Ретровирусные векторы 27
1.9. Выводы по литературному обзору 29
2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Материалы исследования 30
2.2. Перечень сырья и материалов исследования 33
2.3. Методы исследования 35
2.3.1. Твердофазный синтез олигонуклеотидов 35
2.3.2. Сборочная полимеразно-цепная реакция 37
2.3.3. Очистка целевого гена колоночным методом 37
2.3.4. Амплификация целевого гена методом полимеразно-цепной
реакции (ПЦР) 38
2.3.5. Реакция рестрикции-модификации 40
2.3.6. Лигирование фрагментов ДНК 41
2.3.7. Приготовление компетентных бактериальных клеток для
трансформации 42
2.3.8 Трансформация бактериальных клеток методом электропорации 42
2.3.9. Создание банка клеток бактериального штамма 43
2.3.10. Микроскопирование бактериальных культур 44
2.3.11. Культивирование клеток бактериального штамма в биореакторе 45
2.3.12. Выделение плазмиды щелочным методом 47
2.3.13. Получение клеточной культуры фибробластов 49
2.3.14. Приготовление компетентных клеточных культур для трансформации 49
2.3.15. Трансформация клеточных культур методом электропорации 50
2.3.16. Создание банка клеточных культур 50
2.3.17. Микроскопирование клеточных культуры 51
2.3.18. Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле 52
2.3.19. Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле
в восстанавливающих условиях 54
2.3.20. Секвенирование ДНК по методу Сэнгера 59
3. Описание эксперимента 61
Список использованных источников 75
Приложение
1. Аналитический обзор 10
1.1. Характеристика IGF 1 10
1.2. Характеристика IGF-LR3 11
1.2.1. Перспективы применения IGF-LR3 11
1.3. Обзор заболеваний, связанных с нарушением роста 12
1.4. Препараты на основе инсулин-подобного фактора роста 1 13
1.5. Основные этапы разработки генотерапевтического препарата 14
1.5.1. Подготовительный этап 15
1.5.2. Выбор терапевтического гена 15
1.5.3. Выбор пути введения 15
1.5.4. Подбор системы доставки гена 16
1.5.5. Обеспечение клеточной специфичности (клеточный таргетинг) 17
1.5.6. Экспрессия доставленного гена в клетках млекопитающих и человека 17
1.6. Системы доставки терапевтического гена 18
1.7. Классификация невирусных методов доставки 19
1.7.1 Физические методы доставки 19
1.7.1.1. Микроинъекция 19
1.7.1.2. Биобаллистика ДНК 19
1.7.1.3. Электропорация 20
1.7.1.4. Сонопорация 21
1.7.1.5. Фотопорация 22
1.7.1.6. Магнитофекция 22
1.7.1.7. Гидропорация 22
1.7.2 Химические методы доставки 23
1.7.2.1 Неорганические частицы 23
1.7.2.2. Синтетические и натуральные биоразлагаемые носители 24
1.8. Классификация вирусных методов доставки 25
1.8.1. Аденовирусные векторы 26
1.8.2. Аденоассоциированные вирусные векторы 26
1.8.3. Ретровирусные векторы 27
1.9. Выводы по литературному обзору 29
2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Материалы исследования 30
2.2. Перечень сырья и материалов исследования 33
2.3. Методы исследования 35
2.3.1. Твердофазный синтез олигонуклеотидов 35
2.3.2. Сборочная полимеразно-цепная реакция 37
2.3.3. Очистка целевого гена колоночным методом 37
2.3.4. Амплификация целевого гена методом полимеразно-цепной
реакции (ПЦР) 38
2.3.5. Реакция рестрикции-модификации 40
2.3.6. Лигирование фрагментов ДНК 41
2.3.7. Приготовление компетентных бактериальных клеток для
трансформации 42
2.3.8 Трансформация бактериальных клеток методом электропорации 42
2.3.9. Создание банка клеток бактериального штамма 43
2.3.10. Микроскопирование бактериальных культур 44
2.3.11. Культивирование клеток бактериального штамма в биореакторе 45
2.3.12. Выделение плазмиды щелочным методом 47
2.3.13. Получение клеточной культуры фибробластов 49
2.3.14. Приготовление компетентных клеточных культур для трансформации 49
2.3.15. Трансформация клеточных культур методом электропорации 50
2.3.16. Создание банка клеточных культур 50
2.3.17. Микроскопирование клеточных культуры 51
2.3.18. Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле 52
2.3.19. Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле
в восстанавливающих условиях 54
2.3.20. Секвенирование ДНК по методу Сэнгера 59
3. Описание эксперимента 61
Список использованных источников 75
Приложение
Актуальность работы. Инсулин-подобный фактор роста 1 (IGF1, молекулярная масса 7,6 кДа) – гормон, стимулирующий рост тканей организма. Он является основным медиатором действия гормона роста (GH, соматотропина). Гормон роста вырабатывается в передней части гипофиза, выделяясь в кровоток, а
затем, попадая в печень, стимулирует выработку IGF1. Затем IGF1 запускает каскад молекулярных механизмов, вызывающих в конечном итоге системный рост
организма и стимулирующих рост почти всех клеток организма: скелетных
мышц, хрящей, костей, печени, почек, кожи, клеток легких [44].
IGF-LR3 (молекулярная масса 9,1 кДа) - его модифицированный аналог с
удлиненной цепью (L - long) и заменой в третьем положении c C-конца глютамина на аргинин (R3). Преимущество данного белка заключаются в его большей
специфичности по сравнению с природным белком [26]. Препараты на основе
рекомбинантного IGF-LR3 применяются в спортивной медицине для стимуляции роста мышц, сжигания жира. Однако, препараты данного типа являются
запрещенными допинговыми препаратами при подготовке олимпийских
спортсменов.
Патологическая недостаточность IGF1, вызванная генетическими аномалиями, приводит к нарушениям роста, таким, как синдром Ларона [18]. В качестве
терапии при патологической недостаточности данного гормона используется заместительная терапия, которая заключается в пожизненных регулярных подкожных инъекциях препарата. В качестве примера препаратов такого типа можно
привести: Инкрелекс® (Increlex®), представляющий собой рекомбинантный IGF-
1, имеющий период полураспада в организме около 5,8 часов [8]. Известен также
его родственный препарат Иплекс® (Iplex®), представляющий собой комбинацию (троичный комплекс) рекомбинантных белков: IGF1, белка, связывающего
инсулиноподобный фактора роста (IGFBP-3) и белка, связывающего кислотолабильную субъединицу инсулиноподобного фактора роста (IGFALS). Период полураспада у данного препарата вдвое больше и составляет 13,4 часов для лиц с
острой недостаточностью IGF1 [12].8
Относительно невысокий период полураспада известных препаратов стимулируют к поиску новых путей лечения данных патологических состояний.
Генная терапия является одним из перспективных подходов к лечению подобного рода нарушений [11]. Суть генной терапии заключается в парентеральном введении пациенту инъекций нормально функционирующего гена, выполняющего правильную функцию, взамен мутантного.
Исследования эффективности IGF1 для генной терапии описаны в литературе. Так, например, для изучения эффективности данного белка проводилась
стимуляция роста эпителия у крыс в районе открытых поражений кожи с использованием трансдуцированных in vitro фибробластов кДНК IGF1 [3].
Иными словами, IGF1 как и его модифицированный аналог – IGF-LR3, являются перспективными объектами для создания на их основе генотерапевтических молекул.
Объектом настоящих исследований является белок - модифицированный
инсулин-подобный фактор роста 1 (IGF-LR3), предметом данного исследования
является создание челночной экспрессирующей конструкции, кодирующей синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста IGF-LR3 в клетках
прокариот и эукариот.
Таким образом, целью настоящей работы является создание плазмидной
конструкции, способной экспрессировать ген модифицированного инсулин-подобного фактора роста 1 (IGF-LR3) в клетках млекопитающих.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучение литературных источников по выбранной теме.
2. Получение плазмидной конструкции, экспрессирующей целевой ген.
3. Создание рекомбинантного бактериального штамма для наработки плазмидной конструкции, несущей ген IGF-LR3 в опытно-промышленном масштабе.
4. Получение модельной клеточной культуры-продуцента рекомбинантного
белка IGF-LR3.
затем, попадая в печень, стимулирует выработку IGF1. Затем IGF1 запускает каскад молекулярных механизмов, вызывающих в конечном итоге системный рост
организма и стимулирующих рост почти всех клеток организма: скелетных
мышц, хрящей, костей, печени, почек, кожи, клеток легких [44].
IGF-LR3 (молекулярная масса 9,1 кДа) - его модифицированный аналог с
удлиненной цепью (L - long) и заменой в третьем положении c C-конца глютамина на аргинин (R3). Преимущество данного белка заключаются в его большей
специфичности по сравнению с природным белком [26]. Препараты на основе
рекомбинантного IGF-LR3 применяются в спортивной медицине для стимуляции роста мышц, сжигания жира. Однако, препараты данного типа являются
запрещенными допинговыми препаратами при подготовке олимпийских
спортсменов.
Патологическая недостаточность IGF1, вызванная генетическими аномалиями, приводит к нарушениям роста, таким, как синдром Ларона [18]. В качестве
терапии при патологической недостаточности данного гормона используется заместительная терапия, которая заключается в пожизненных регулярных подкожных инъекциях препарата. В качестве примера препаратов такого типа можно
привести: Инкрелекс® (Increlex®), представляющий собой рекомбинантный IGF-
1, имеющий период полураспада в организме около 5,8 часов [8]. Известен также
его родственный препарат Иплекс® (Iplex®), представляющий собой комбинацию (троичный комплекс) рекомбинантных белков: IGF1, белка, связывающего
инсулиноподобный фактора роста (IGFBP-3) и белка, связывающего кислотолабильную субъединицу инсулиноподобного фактора роста (IGFALS). Период полураспада у данного препарата вдвое больше и составляет 13,4 часов для лиц с
острой недостаточностью IGF1 [12].8
Относительно невысокий период полураспада известных препаратов стимулируют к поиску новых путей лечения данных патологических состояний.
Генная терапия является одним из перспективных подходов к лечению подобного рода нарушений [11]. Суть генной терапии заключается в парентеральном введении пациенту инъекций нормально функционирующего гена, выполняющего правильную функцию, взамен мутантного.
Исследования эффективности IGF1 для генной терапии описаны в литературе. Так, например, для изучения эффективности данного белка проводилась
стимуляция роста эпителия у крыс в районе открытых поражений кожи с использованием трансдуцированных in vitro фибробластов кДНК IGF1 [3].
Иными словами, IGF1 как и его модифицированный аналог – IGF-LR3, являются перспективными объектами для создания на их основе генотерапевтических молекул.
Объектом настоящих исследований является белок - модифицированный
инсулин-подобный фактор роста 1 (IGF-LR3), предметом данного исследования
является создание челночной экспрессирующей конструкции, кодирующей синтез модифицированного инсулин-подобного фактора роста IGF-LR3 в клетках
прокариот и эукариот.
Таким образом, целью настоящей работы является создание плазмидной
конструкции, способной экспрессировать ген модифицированного инсулин-подобного фактора роста 1 (IGF-LR3) в клетках млекопитающих.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучение литературных источников по выбранной теме.
2. Получение плазмидной конструкции, экспрессирующей целевой ген.
3. Создание рекомбинантного бактериального штамма для наработки плазмидной конструкции, несущей ген IGF-LR3 в опытно-промышленном масштабе.
4. Получение модельной клеточной культуры-продуцента рекомбинантного
белка IGF-LR3.
Был проведен анализ литературы, показана актуальность данного исследования, а также актуальность создания генетической конструкции, экспрессирующей ген модифицированного иснулин-подобного фактора роста 1 (IGF-LR3) в
качестве активной молекулы для получения генотерапевтического препарата.
В результате генно-инженерных экспериментов была получена плазмида,
кодирующая синтез IGF-LR3 - pcDNA3.1(+)-IGF-LR3.
Далее был получен рекомбинантный штамм E.coli DH5α/pcDNA3.1(+)-IGFLR3, несущий плазмиду, кодирующую ген IGF-LR3.
Было показано, что полученный штамм перспективно использовать для получения опытно-промышленных количеств плазмидной ДНК, способной экспрессироваться в клетках млекопитающих. Была выделена щелочным методом и
в дальнейшем использована для создания рекомбинантной клеточной культуры
плазмида pcDNA3.1(+)-IGF-LR3.
Таким образом, разработана технология получения генетического материала (плазмиды pcDNA3.1(+)-IGF-LR3) в опытно-промышленном масштабе.
Также получена модельная клеточная культура клеток фибробластов fib7.
Создана рекомбинантная клеточная культура клеток фибробластов
fib7/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 - продуцент рекомбинантного белка IGF-LR3. Показана экспрессия рекомбинантного белка в клетках фибробластов методом вертикального электрофореза в восстанавливающих условиях.
Проведен анализ и подтверждено соответствие ориентации и места встраивания гена IGF-LR3 в плазмиду методом секвенирования по методу Сэнгера.
Таким образом, была получена рекомбинантная ДНК, кодирующая синтез
модифицированного инсулин-подобного фактора роста (IGF-LR3), что соответствует поставленной цели исследования.
качестве активной молекулы для получения генотерапевтического препарата.
В результате генно-инженерных экспериментов была получена плазмида,
кодирующая синтез IGF-LR3 - pcDNA3.1(+)-IGF-LR3.
Далее был получен рекомбинантный штамм E.coli DH5α/pcDNA3.1(+)-IGFLR3, несущий плазмиду, кодирующую ген IGF-LR3.
Было показано, что полученный штамм перспективно использовать для получения опытно-промышленных количеств плазмидной ДНК, способной экспрессироваться в клетках млекопитающих. Была выделена щелочным методом и
в дальнейшем использована для создания рекомбинантной клеточной культуры
плазмида pcDNA3.1(+)-IGF-LR3.
Таким образом, разработана технология получения генетического материала (плазмиды pcDNA3.1(+)-IGF-LR3) в опытно-промышленном масштабе.
Также получена модельная клеточная культура клеток фибробластов fib7.
Создана рекомбинантная клеточная культура клеток фибробластов
fib7/pcDNA3.1(+)-IGF-LR3 - продуцент рекомбинантного белка IGF-LR3. Показана экспрессия рекомбинантного белка в клетках фибробластов методом вертикального электрофореза в восстанавливающих условиях.
Проведен анализ и подтверждено соответствие ориентации и места встраивания гена IGF-LR3 в плазмиду методом секвенирования по методу Сэнгера.
Таким образом, была получена рекомбинантная ДНК, кодирующая синтез
модифицированного инсулин-подобного фактора роста (IGF-LR3), что соответствует поставленной цели исследования.