Введение
Теоретические основы методов исследования 6
1.1 Общие принципы двумерной спектроскопии ЯМР 6
1.1.1 Корреляционная спектроскопия 9
1.1.2 NOESY спектроскопия 16
1.1.3 Эксперимент DOSY 18
1.2 Подавление сигнала растворителя в спектрах ЯМР 20
1.2.1 Преднасыщение и биномиальная импульсная последовательность 21
1.2.2 Спин-лок и импульсный градиент магнитного поля для устранения сигнала
растворителя 25
1.2.3 Постэкспериментальная обработка сигнала 28
1.3 Общие принципы моделирования структуры 29
1.3.1 Метод симулированного отжига 35
1.3.2 Использование дополнительных потенциалов 37
2 Первичная структура и функции бычьего инсулина 44
2.1 Экспериментальная часть 47
3 Исследование пространственной структуры бычьего инсулина 48
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 62
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 63
ПРИЛОЖЕНИЕ
Знание структуры белков в растворе и в комплексе с другими молекулами представляет большой интерес для понимания их фармакологического действия. Непременным условием для установления структуры и свойств образца с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) является соотнесение сигналов в спектрах [1]. Для выполнения соотнесения обычно пользуются одно- и двумерными спектрами [2].
Инсулин является незаменимым лекарством для больных сахарным диабетом, поскольку он оказывает влияние на обмен глюкозы в организме [3-5]. Понимание механизма взаимодействия семейства инсулинов с мицеллярными образованиями представляет интерес в настоящее время, так как в будущем это может позволить создавать более эффективные и удобные лекарства (например, принимать инсулин перорально). Хотя понимание взаимодействия инсулина с рецептором и клеточной мембраной было достигнуто за последнее десятилетие, к сожалению, некоторые вопросы остаются до конца нерешенными [6-16]. Кроме того, в настоящее время активно ведутся разработки полимерных оболочек, внутри которых содержится инсулин [17-22], а также активно исследуется влияние наночастиц на стабилизацию структуры инсулина [23-26] с целью адресной доставки лекарственного средства. С другой стороны, физико-химические свойства, такие как растворимость и стабильность, особенно важны в приготовлении лекарственных препаратов.
Для создания терапевтических форм инсулина часто требуется наличие иона цинка Zn2+, в присутствие которого происходит гексамеризация (6 мономеров) инсулина [27, 28]. Данное число олигомеров является отнюдь не случайным, поскольку хранение инсулина в организме человека происходит именно в гексамерной форме [29], а далее, после поступления в кровь, происходит разделение на мономеры [30]. Существует две разновидности гексамеров инсулина - T6и R6 [31-33], однако, по данным последних
исследований, активной является только форма Т6 [34]. Между двумя формами постоянно происходят переходы [35, 36]. Кроме того, в настоящее время активно ведется разработка генно-инженерных форм инсулина, с измененной аминокислотной последовательностью, с целью достижения пролонгированного действия лекарственного препарата [37-39]. Совместно с этим ведется поиск структуры [40-43] и исследование динамики данных инженерно- модифицированных инсулинов [44-47], а также белка-предшественника - проинсулина [48].
В качестве образца исследования был выбран бычий инсулин. Бычий инсулин отличается от человеческого тремя аминокислотными остатками, и вследствие этого факта лечение бычьим инсулином вызывало побочные действия и аллергические реакции [49]. Бычий инсулин состоит из 51 аминокислоты. Хотя в настоящее время существует множество методов для синтеза инсулина [50-54], наиболее простым является его выделение из живой клетки (печени быка) [55]. Первым шагом является запись спектров, обработка и их соотнесение, т.е. приписание сигналов [56]. Из-за такого большого количества аминокислот соотнесение сигналов представляло собой непростую задачу, поскольку образец был с природным содержанием изотопов [57]. Впервые были получены значения химического сдвига ядер 1Н и 13С основной и боковых цепей. Следующим шагом являлся анализ полученных данных и моделирование структуры, которая была до настоящего момента неизвестна. В свою очередь знание трехмерной конфигурации молекулы позволяет исследовать взаимодействие с клеточными структурами.
Кроме того, в данной работе поднят вопрос об агрегации бычьего инсулина. Межмолекулярная близость способствует формированию 0- складчатых элементов, которые могут объяснить дальнейшую олигомеризацию небольших пептидов, таких, как амилоидные белки [58] или протегрины [59, 60]. Подобное поведение человеческого инсулина было замечено достаточно давно [61], его способность к агрегации зависит от многих внешних факторов (температура, кислотность среды, ионная сила), и, помимо этого, от определенной последовательности аминокислотных остатков. Несмотря на это, данная проблема по-прежнему является очень важной, являясь стимулом к поиску поиск новых производных инсулина и ингибиторов фибриллизации инсулина [62-67].
Итак, целью данной работы является исследование пространственной структуры (координаты атомов протеина в .pdb формате) бычьего инсулина в растворе по данным современных методов (включая двумерную) спектроскопии ЯМР высокого разрешения.
1) Зарегистрированы двумерные спектры ЯМР TOCSY и NOESY, и проведено полное соотнесение сигналов ядер 1H и 13C (кроме сигналов карбонильных углеродов).
2) Из анализа экспериментальных данных ЯМР спектроскопии NOESY были найдены ограничения на расстояния и двугранные углы в молекуле.
3) Впервые была получена пространственная структура (координаты атомов протеина в .pdb формате) бычьего инсулина в водном растворе. Результаты депонированы в международную базу данных структур Protein Data Bank (PDB ID 5MIZ).
4) Линейные размеры смоделированной молекулы находятся в соответствии с теми, которые были получены экспериментально из спектров ЯМР DOSY и анализа времён корреляции при большом разбавлении.
5) Показано, что подвижность молекулы меняется с изменением концентрации образца, что является свидетельством наличия обменных процессов между мономерной и димерной формами инсулина в растворе.
6) Качество полученной структуры подтверждено построением графика Рамачандрана, а также вычислением среднеквадратичного отклонения положений тяжелых атомов основной цепи от среднего.
