Исследование пространственной структуры антимикробных пептидов PG-2 и PG-З в растворе с мицеллами на основе данных спектроскопии ЯМР высокого разрешения
|
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
ВВЕДЕНИЕ 3
1 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 9
1.1 Основы ЯМР спектроскопии 9
1.2 Двумерная спектроскопия ЯМР 17
1.3 Гомоядерный эксперимент COSY 21
1.4 Гомоядерный эксперимент TOCSY 28
1.5 Ядерный эффект Оверхаузера. Эксперимент NOESY 30
1.5.1 Определение межпротонных расстояний 33
1.5.2 Интенсивность кросс-пиков в NOESY эксперименте 34
1.5.3 Влияние молекулярного веса на интенсивность кросс-пиков 35
1.6 Расчет структуры белка 38
1.6.1 Минимизация потенциальной энергии системы атомов 43
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 47
2.1 Материалы, методы и объекты исследования 47
2.2 Результаты измерений 48
2.2.1 Структура антимикробного пептида PG-2 в комплексе с мицеллами ДФХ 48
2.2.2 Структура антимикробного пептида PG-3 в комплексе с мицеллами ДФХ 56
ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 64
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ВВЕДЕНИЕ 3
1 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 9
1.1 Основы ЯМР спектроскопии 9
1.2 Двумерная спектроскопия ЯМР 17
1.3 Гомоядерный эксперимент COSY 21
1.4 Гомоядерный эксперимент TOCSY 28
1.5 Ядерный эффект Оверхаузера. Эксперимент NOESY 30
1.5.1 Определение межпротонных расстояний 33
1.5.2 Интенсивность кросс-пиков в NOESY эксперименте 34
1.5.3 Влияние молекулярного веса на интенсивность кросс-пиков 35
1.6 Расчет структуры белка 38
1.6.1 Минимизация потенциальной энергии системы атомов 43
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 47
2.1 Материалы, методы и объекты исследования 47
2.2 Результаты измерений 48
2.2.1 Структура антимикробного пептида PG-2 в комплексе с мицеллами ДФХ 48
2.2.2 Структура антимикробного пептида PG-3 в комплексе с мицеллами ДФХ 56
ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 64
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Среди физико-химических методов исследования пространственной структуры органических соединений важное место занимает спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения. Наряду с данными рентгеноструктурного анализа (РСА) и методов молекулярной динамики (МД), результаты применения методов ЯМР высокого разрешения являются необходимыми и важными для исследования молекулярной структуры и динамики биологических макромолекул в растворе. Большое разнообразие экспериментальных методик ядерного магнитного резонанса, применяемых для решения проблем структурной биологии, медицинской физики, органической химии, безусловно, ставят спектроскопию ЯМР высокого разрешения в особое положение по отношению к другим спектральным методам.
Традиционно исследования пространственного строения органических соединений в растворах основаны на использовании современных подходов в ЯМР, таких как двумерная ЯМР NOESY спектроскопия (спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера), которая позволяет определять расстояния между магнитными ядрами, не связанными посредством спин-спинового взаимодействия и отстоящими друг от друга на расстоянии до 5 А [1].
В настоящее время исследование пространственной структуры комплекса пептида с моделью биологической мембраны представляет большой интерес для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, протекающих на поверхности клеток [2-4].
В среднем у белков около 60% полипептидной цепи существует в виде упорядоченных вторичных структур: ц-спираль или 0-лист. Остальная часть молекулы существует в виде неупорядоченной структуры (случайный клубок или виток). В ц-спиральной структуре (Рисунок 1) карбонильный кислород каждой пептидной связи образует водородную связь с амидным водородом
через четыре аминокислотных остатка, таким образом полипептидная цепь скручивается в спираль, на каждый виток приходится 3,6 аминокислотных остатка.
Другая упорядоченная вторичная структура - 0-складка. Эта разновидность вторичной структуры имеет изогнутую конфигурацию полипептидной цепи и формируется с помощью межпептидных водородных связей в пределах отдельных участков одной полипептидной цепи или смежных полипептидных цепей (Рисунок 2). Водородные связи между атомами в смежных 0-складках формируют структуру так называемого 0-листа. В 0- листе 0-складки могут быть ориентированы относительно друг друга параллельно или антипарально. Если связанные полипептидные цепи направлены противоположно, возникает антипараллельная структура, если же N- и С-концы полипептидных цепей совпадают, образуется структура параллельного складчатого слоя [51].
Определение пространственной структуры и положения элементов со вторичной структурой белка является важным этапом процесса понимания молекулярных процессов протекающих в живой клетке. На основе полученных данных анализируется процессы динамики и взаимодействия белка с другими молекулами, такими как нуклеиновые кислоты и лиганды.
В рамках данной работы в качестве объектов исследования были выбраны следующие пептиды: протегрин - 2 (PG-2) и протегрин - 3 (PG-3) (аминокислотные последовательности в общепринятых буквенных кодах, соответствующих номенклатуре IUPAC/IUBMB приведены на рисунке 3).
Данные соединения относятся к классу цитотоксичных пептидов и играют важную роль в иммунных системах множества организмов. Антимикробные пептиды являются подклассом цитотоксичных пептидов. Они могут обеспечить быструю реакцию на инфекцию и часто эффективны против широкого спектра видов бактерий, грибов и вирусов. Различают следующие группы антимикробных пептидов: магаинины, цекропины, бомбинины, дефензины и протегрины (PG) (Рисунок 3) [5-9,25]. Первые три группы пептидов при связывании с липидной мембраной образуют альфа-спиральные структуры, пептиды из двух последних групп образуют бета-складчатые структуры, которые стабилизированы дисульфидными связями.
Согласно результатам последних исследований пептидов, способных к проникновению в клеточную мембрану, протегрины и ряд цитолитических пептидов с бета-складчатой структурой имеют схожие механизмы действия [5]. Так как цитотоксичное действие таких пептидов как протегрины проявляется в результате их взаимодействия с клеточной мембраной, то для понимания молекулярного механизма действия таких пептидов, необходима информация о пространственном строении комплекса «пептид - модельная мембрана», а также о строении данных пептидов в растворе.
Исследования структуры протегрина PG-1 показали, что он способен образовывать димер в растворе с мицеллами додецилфосфохолина (ДФХ) (PDB: 1ZY6) [10], в дальнейшем ассоциация нескольких димеров образует канал в мембране клетки [23,29], однако молекулярный механизм разрушения клеток не а-спиральными пептидами до сих пор не известен [11]. Изучение образования димера протегрина PG-1 является важным этапом для понимания процесса образования пор в липидном бислое, так как димер может являться составной единицей при ассоциации более крупных упорядоченных агрегатов [12]. Несмотря на то, что протегрину PG-1 посвящено большое количество работ, остальные протегрины PG-2 - PG-5 остаются пока недостаточно изученными [33-36].
Исследования активности протегринов против дрожжей Candida albicans показали, что протегрины PG-2, -3, и -5, но не PG-4, обладают такой же эффективностью, как и PG-1 [13]. Согласно этим исследованиям, минимально необходимой структурой в аминокислотной последовательности протегринов для сохранения активности против широкого спектра бактерий являются 12 аминокислотных остатков, и, по крайней мере, 4 дополнительных остатка необходимы для того, чтобы протегрин обладал мощными противогрибковыми свойствами. Таким образом, протегрин PG-2, состоящий из 16 аминокислотных остатков, представляет собой минимальную структуру пептида обладающей широким спектром противогрибковой и антибактериальной активности [13].
Для того чтобы выявить структурные различия и сходства между уже изученным протегрином PG-1 и протегринами PG-2 и PG-3, повысить активность и селективность данных пептидов, необходимо исследовать структуру и функции протегринов PG-2 и PG-3 методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения [26,27]. Для установления вторичной структуры белков, важно исследовать данные пептиды в среде с добавлением модельных мембран, имитирующих поверхность клеток [28,31,32].
Итак, целью настоящей работы являлось изучение антимикробных пептидов PG-2 и PG-3 с нативным содержанием изотопов в комплексе с моделью биологической мембраны на основе ДФХ в растворе и установление их пространственных структур методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Регистрация необходимых для исследования одно- и двумерных спектров ЯМР;
2. Анализ и полное соотнесение сигналов в спектрах ЯМР PG-2 и PG-3;
3. Расчет пространственной структуры мономеров и димеров исследуемых объектов на основе полученных экспериментальных данных.
Традиционно исследования пространственного строения органических соединений в растворах основаны на использовании современных подходов в ЯМР, таких как двумерная ЯМР NOESY спектроскопия (спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера), которая позволяет определять расстояния между магнитными ядрами, не связанными посредством спин-спинового взаимодействия и отстоящими друг от друга на расстоянии до 5 А [1].
В настоящее время исследование пространственной структуры комплекса пептида с моделью биологической мембраны представляет большой интерес для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, протекающих на поверхности клеток [2-4].
В среднем у белков около 60% полипептидной цепи существует в виде упорядоченных вторичных структур: ц-спираль или 0-лист. Остальная часть молекулы существует в виде неупорядоченной структуры (случайный клубок или виток). В ц-спиральной структуре (Рисунок 1) карбонильный кислород каждой пептидной связи образует водородную связь с амидным водородом
через четыре аминокислотных остатка, таким образом полипептидная цепь скручивается в спираль, на каждый виток приходится 3,6 аминокислотных остатка.
Другая упорядоченная вторичная структура - 0-складка. Эта разновидность вторичной структуры имеет изогнутую конфигурацию полипептидной цепи и формируется с помощью межпептидных водородных связей в пределах отдельных участков одной полипептидной цепи или смежных полипептидных цепей (Рисунок 2). Водородные связи между атомами в смежных 0-складках формируют структуру так называемого 0-листа. В 0- листе 0-складки могут быть ориентированы относительно друг друга параллельно или антипарально. Если связанные полипептидные цепи направлены противоположно, возникает антипараллельная структура, если же N- и С-концы полипептидных цепей совпадают, образуется структура параллельного складчатого слоя [51].
Определение пространственной структуры и положения элементов со вторичной структурой белка является важным этапом процесса понимания молекулярных процессов протекающих в живой клетке. На основе полученных данных анализируется процессы динамики и взаимодействия белка с другими молекулами, такими как нуклеиновые кислоты и лиганды.
В рамках данной работы в качестве объектов исследования были выбраны следующие пептиды: протегрин - 2 (PG-2) и протегрин - 3 (PG-3) (аминокислотные последовательности в общепринятых буквенных кодах, соответствующих номенклатуре IUPAC/IUBMB приведены на рисунке 3).
Данные соединения относятся к классу цитотоксичных пептидов и играют важную роль в иммунных системах множества организмов. Антимикробные пептиды являются подклассом цитотоксичных пептидов. Они могут обеспечить быструю реакцию на инфекцию и часто эффективны против широкого спектра видов бактерий, грибов и вирусов. Различают следующие группы антимикробных пептидов: магаинины, цекропины, бомбинины, дефензины и протегрины (PG) (Рисунок 3) [5-9,25]. Первые три группы пептидов при связывании с липидной мембраной образуют альфа-спиральные структуры, пептиды из двух последних групп образуют бета-складчатые структуры, которые стабилизированы дисульфидными связями.
Согласно результатам последних исследований пептидов, способных к проникновению в клеточную мембрану, протегрины и ряд цитолитических пептидов с бета-складчатой структурой имеют схожие механизмы действия [5]. Так как цитотоксичное действие таких пептидов как протегрины проявляется в результате их взаимодействия с клеточной мембраной, то для понимания молекулярного механизма действия таких пептидов, необходима информация о пространственном строении комплекса «пептид - модельная мембрана», а также о строении данных пептидов в растворе.
Исследования структуры протегрина PG-1 показали, что он способен образовывать димер в растворе с мицеллами додецилфосфохолина (ДФХ) (PDB: 1ZY6) [10], в дальнейшем ассоциация нескольких димеров образует канал в мембране клетки [23,29], однако молекулярный механизм разрушения клеток не а-спиральными пептидами до сих пор не известен [11]. Изучение образования димера протегрина PG-1 является важным этапом для понимания процесса образования пор в липидном бислое, так как димер может являться составной единицей при ассоциации более крупных упорядоченных агрегатов [12]. Несмотря на то, что протегрину PG-1 посвящено большое количество работ, остальные протегрины PG-2 - PG-5 остаются пока недостаточно изученными [33-36].
Исследования активности протегринов против дрожжей Candida albicans показали, что протегрины PG-2, -3, и -5, но не PG-4, обладают такой же эффективностью, как и PG-1 [13]. Согласно этим исследованиям, минимально необходимой структурой в аминокислотной последовательности протегринов для сохранения активности против широкого спектра бактерий являются 12 аминокислотных остатков, и, по крайней мере, 4 дополнительных остатка необходимы для того, чтобы протегрин обладал мощными противогрибковыми свойствами. Таким образом, протегрин PG-2, состоящий из 16 аминокислотных остатков, представляет собой минимальную структуру пептида обладающей широким спектром противогрибковой и антибактериальной активности [13].
Для того чтобы выявить структурные различия и сходства между уже изученным протегрином PG-1 и протегринами PG-2 и PG-3, повысить активность и селективность данных пептидов, необходимо исследовать структуру и функции протегринов PG-2 и PG-3 методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения [26,27]. Для установления вторичной структуры белков, важно исследовать данные пептиды в среде с добавлением модельных мембран, имитирующих поверхность клеток [28,31,32].
Итак, целью настоящей работы являлось изучение антимикробных пептидов PG-2 и PG-3 с нативным содержанием изотопов в комплексе с моделью биологической мембраны на основе ДФХ в растворе и установление их пространственных структур методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Регистрация необходимых для исследования одно- и двумерных спектров ЯМР;
2. Анализ и полное соотнесение сигналов в спектрах ЯМР PG-2 и PG-3;
3. Расчет пространственной структуры мономеров и димеров исследуемых объектов на основе полученных экспериментальных данных.
На основе экспериментальных данных двумерных экспериментов ЯМР и теоретического моделирования молекулярной структуры (с использованием программы XPLOR-NIH) определена пространственная структура пептидов PG-2 и PG-3 и димера PG-3 в растворе с мицеллами ДФХ. Полученная спектральная информация и пространственная структура были депонированы в международные базы данных Protein Data Bank (PDB: 2MUH, 2MZ6) и BioMagResBank (25212, 25474).
Выводы:
• Установлено, что исследуемые пептиды в растворе с мицеллами ДФХ образуют 0-складку.
• Установлено, что для протегринов взаимодействие пептидов с мицеллами происходит за счет расположения гидрофобных областей пептидов вблизи поверхности мицеллы.
• Установлено, что PG-3 в растворе с мицеллами ДФХ образует антипараллельный димер.
• Показано наличие механизма дальнейшей ассоциации димеров в олигомеры - бочковидные поры, которые могут являться причиной гибели клеток.
Результаты данной работы расширяют знания об антимикробных пептидах протегринах и могут быть в дальнейшем полезны для разработки новых препаратов, способных противостоять многим вирусам, бактериям и грибам
Выводы:
• Установлено, что исследуемые пептиды в растворе с мицеллами ДФХ образуют 0-складку.
• Установлено, что для протегринов взаимодействие пептидов с мицеллами происходит за счет расположения гидрофобных областей пептидов вблизи поверхности мицеллы.
• Установлено, что PG-3 в растворе с мицеллами ДФХ образует антипараллельный димер.
• Показано наличие механизма дальнейшей ассоциации димеров в олигомеры - бочковидные поры, которые могут являться причиной гибели клеток.
Результаты данной работы расширяют знания об антимикробных пептидах протегринах и могут быть в дальнейшем полезны для разработки новых препаратов, способных противостоять многим вирусам, бактериям и грибам