Помощь студентам в учебе
Структурные исследования инактивации белка рибосомы (HPF) бактерии Staphylococcus Aureus методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения
|
Список сокращений 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Staphylococcus aureus 7
1.2 Фактор гибернации SaHPF из S.aureus 7
1.3 Структура фактора HPF из E.Coli 10
1.4 Структура SaHPF предсказанная с помощью биоинформатических методов13
1.5 Протокол выделения и очистки белка 16
1.6 Выделение плазмидной ДНК из бактерий E. coli 18
1.6.2 Лизис клеток 18
1.6.3 Очистка белка 20
1.7 Основы спектроскопии ЯМР 21
1.8 Многомерные эксперименты спектроскопии ЯМР 24
1.8.1 Эксперимент HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation spectroscopy) 26
1.8.2 HNCO и HNCA 26
1.8.3 Эксперимент HNCO 27
1.8.4 Эксперимент HNCA 28
1.8.5 Эксперимент HN(CO)CA 29
1.8.6 Эксперимент CBCANH 31
1.8.7 Эксперимент CBCA(CO)NH 32
2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦА БЕЛКА ДЛЯ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР 35
2.1 Приготовление образцов для спектроскопии ЯМР 35
2.2 Этапы выделения белка SaHPF из клеток E.Coli 36
2.3 Очистка белка SaHPF на колонке со смолой Ni-NTA Superflow 37
2.4 Осаждение белка в растворе 37
2.5 Конечная стадия очистки белка SaHPF на гель-фильтрационной колонке
Superdex 75 10/300 38
2.6 Электрофорез белка 38
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ПО СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР 41
3.1 Эксперименты 15N-1H HSQC 41
3.2 Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 43
Заключение 47
Библиографический список 48
Приложение 1 54
Приложение 2
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Staphylococcus aureus 7
1.2 Фактор гибернации SaHPF из S.aureus 7
1.3 Структура фактора HPF из E.Coli 10
1.4 Структура SaHPF предсказанная с помощью биоинформатических методов13
1.5 Протокол выделения и очистки белка 16
1.6 Выделение плазмидной ДНК из бактерий E. coli 18
1.6.2 Лизис клеток 18
1.6.3 Очистка белка 20
1.7 Основы спектроскопии ЯМР 21
1.8 Многомерные эксперименты спектроскопии ЯМР 24
1.8.1 Эксперимент HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation spectroscopy) 26
1.8.2 HNCO и HNCA 26
1.8.3 Эксперимент HNCO 27
1.8.4 Эксперимент HNCA 28
1.8.5 Эксперимент HN(CO)CA 29
1.8.6 Эксперимент CBCANH 31
1.8.7 Эксперимент CBCA(CO)NH 32
2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦА БЕЛКА ДЛЯ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР 35
2.1 Приготовление образцов для спектроскопии ЯМР 35
2.2 Этапы выделения белка SaHPF из клеток E.Coli 36
2.3 Очистка белка SaHPF на колонке со смолой Ni-NTA Superflow 37
2.4 Осаждение белка в растворе 37
2.5 Конечная стадия очистки белка SaHPF на гель-фильтрационной колонке
Superdex 75 10/300 38
2.6 Электрофорез белка 38
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ПО СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР 41
3.1 Эксперименты 15N-1H HSQC 41
3.2 Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 43
Заключение 47
Библиографический список 48
Приложение 1 54
Приложение 2
Кокки - это разновидность бактерий, имеющих овальную или округлую форму, kokkos (означает по-гречески "зернышко"). В 1881 году, введен микробиологический термин “staphylococcus”,описывающий определенный вид бактерии. В окружающем мире множество самых разнообразных кокков, соседствующих с человеком на протяжении всей его жизни, но, самый известный всем микроб - это стафилококк. Рассматривая бактерии под микроскопом, можно заметить, что кокки собираются в группы, похожие на гроздь винограда, отсюда и название, staphylos (по-гречески означающее "гроздь"). Стафилококки - это род микроорганизмов, 27 видов из которых уже обнаружены на данный момент, 14 найдены на кожных покровах и слизистых человека. Большинство стафилококков являются безвредными для человека: но, из тех 14 видов, 3 имеют факторы патогенности, способные вызывать опасные для жизни болезни.
Эти три вида стафилококка: золотистый стафилококк (staphylococcus aureus), эпидермальный стафилококк (S.epidermidis), сапрофитный стафилококк (S. saprophyticus). В данной работе исследовался именно золотистый стафилококк, т.к. он является самым опасным.
Стафилококковая инфекция - обобщенное название для ряда заболеваний, вызываемых стафилококком. Из-за высокой устойчивости к антибиотикам, данные инфекции находятся на первом месте среди инфекционных заболеваний, носящих гнойно-воспалительный характер. Стафилококк способен вызывать практически в любом органе человека различные воспалительные процессы. При поражении внутренних органов, стафилококк может вызвать ангину, менингит, пневмонию, или же вовсе абсцессы внутренних органов. Как причина гнойных воспалений на коже, стафилококк проявляется в виде различных фурункулов, пиодермии. Являясь патогенными видами бактерий, стафилококки продуцируют энтеротоксин, имеющий антигенные свойства. Именно он является выделяемым фактором, вызывающим причины острых пищевых токсикоинфекции, гастроэнтерита и воспалений тонкой и толстой кишки.
Структурная биология является разделом молекулярной биологии, биохимии и биофизики, занимающийся изучением структуры биологических макромолекул, в частности белков и нуклеиновых кислот. С помощью изучения трехмерной структуры молекул методами рентгеноструктурного анализа, криоэлектронной микроскопии и ядерного магнитного резонанса, можно понять механизмы, протекающие в живых системах на молекулярном уровне.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения - один из самых информативных методов исследования молекулярной структуры и динамики биологических макромолекул в растворе. Применяется для решения проблем структурной биологии, медицинской физики, органической химии [1]. На основе экспериментальных данных ЯМР возможно определение параметров структуры исследуемой молекулы, например, из спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY), возможно определение межпротонных расстояний между магнитными ядрами, отстоящими друг от друга на расстоянии менее 5 А [2, с.4].
Целью данной работы является выделения и очистка белка с мечеными изотопами по ядрам 15N и/или 13C в системе E.coliдля ЯМР исследований на примере специфического белка SaHPF, инактивирующего рибосомы бактерии Staphylococcus aureus,и экспериментальным путем изучения его структуры в дальнейшем с помощью спектроскопии ЯМР. Для достижения указанной цели необходимо выполнение следующих задач:
1) Разработка протокола экспрессии белка (наращивание культуры клеток E. coliс вставкой SaHPF; выделение белка SaHPF из клеток E. Coli; очистка белка SaHPF на колонке со смолой; осаждение белка в растворе; и конечная стадия очистки белка SaHPF на гельфильтрационной колонке).
2) Регистрация многомерных спектров ЯМР по ядрам 1H, 13C, 15N.
3) Анализ экспериментальных данных ЯМР, отнесение сигналов в спектрах к соответствующим магнитным ядрам молекулы белка.
Работа состоит из трех глав. В первой главе, носящей вводный характер, приведены основные понятия теории спектроскопии ЯМР, краткое описание исследуемого образца и основы методов выделения белков. Во второй главе описан разработанный протокол выращивания и очистки белка SaHPF золотистого стафилококка. Третья глава посвящена анализу экспериментальных данных спектроскопии ЯМР.
Актуальность исследования заключается в том, что исследуемый специфичный для стафилококка фактор инактивации рибосомы (SaHPF) с молекулярным весом 22 000 Да был обнаружен в стационарной фазе рибосом золотистого стафилококка, и его функция заключается в стрессовых для бактериальной клетки условиях в замедлении белкового синтеза за счет того, что рибосомы взаимодействуя с данным белком образуют трансляционно не активный 100S димер. В этой фазе бактериальные клетки устойчивы к внешним стресс условиям, что обеспечивает их резистентность к антимикробным агентам. Структура данного белка на данный момент не известна.
Эти три вида стафилококка: золотистый стафилококк (staphylococcus aureus), эпидермальный стафилококк (S.epidermidis), сапрофитный стафилококк (S. saprophyticus). В данной работе исследовался именно золотистый стафилококк, т.к. он является самым опасным.
Стафилококковая инфекция - обобщенное название для ряда заболеваний, вызываемых стафилококком. Из-за высокой устойчивости к антибиотикам, данные инфекции находятся на первом месте среди инфекционных заболеваний, носящих гнойно-воспалительный характер. Стафилококк способен вызывать практически в любом органе человека различные воспалительные процессы. При поражении внутренних органов, стафилококк может вызвать ангину, менингит, пневмонию, или же вовсе абсцессы внутренних органов. Как причина гнойных воспалений на коже, стафилококк проявляется в виде различных фурункулов, пиодермии. Являясь патогенными видами бактерий, стафилококки продуцируют энтеротоксин, имеющий антигенные свойства. Именно он является выделяемым фактором, вызывающим причины острых пищевых токсикоинфекции, гастроэнтерита и воспалений тонкой и толстой кишки.
Структурная биология является разделом молекулярной биологии, биохимии и биофизики, занимающийся изучением структуры биологических макромолекул, в частности белков и нуклеиновых кислот. С помощью изучения трехмерной структуры молекул методами рентгеноструктурного анализа, криоэлектронной микроскопии и ядерного магнитного резонанса, можно понять механизмы, протекающие в живых системах на молекулярном уровне.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения - один из самых информативных методов исследования молекулярной структуры и динамики биологических макромолекул в растворе. Применяется для решения проблем структурной биологии, медицинской физики, органической химии [1]. На основе экспериментальных данных ЯМР возможно определение параметров структуры исследуемой молекулы, например, из спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY), возможно определение межпротонных расстояний между магнитными ядрами, отстоящими друг от друга на расстоянии менее 5 А [2, с.4].
Целью данной работы является выделения и очистка белка с мечеными изотопами по ядрам 15N и/или 13C в системе E.coliдля ЯМР исследований на примере специфического белка SaHPF, инактивирующего рибосомы бактерии Staphylococcus aureus,и экспериментальным путем изучения его структуры в дальнейшем с помощью спектроскопии ЯМР. Для достижения указанной цели необходимо выполнение следующих задач:
1) Разработка протокола экспрессии белка (наращивание культуры клеток E. coliс вставкой SaHPF; выделение белка SaHPF из клеток E. Coli; очистка белка SaHPF на колонке со смолой; осаждение белка в растворе; и конечная стадия очистки белка SaHPF на гельфильтрационной колонке).
2) Регистрация многомерных спектров ЯМР по ядрам 1H, 13C, 15N.
3) Анализ экспериментальных данных ЯМР, отнесение сигналов в спектрах к соответствующим магнитным ядрам молекулы белка.
Работа состоит из трех глав. В первой главе, носящей вводный характер, приведены основные понятия теории спектроскопии ЯМР, краткое описание исследуемого образца и основы методов выделения белков. Во второй главе описан разработанный протокол выращивания и очистки белка SaHPF золотистого стафилококка. Третья глава посвящена анализу экспериментальных данных спектроскопии ЯМР.
Актуальность исследования заключается в том, что исследуемый специфичный для стафилококка фактор инактивации рибосомы (SaHPF) с молекулярным весом 22 000 Да был обнаружен в стационарной фазе рибосом золотистого стафилококка, и его функция заключается в стрессовых для бактериальной клетки условиях в замедлении белкового синтеза за счет того, что рибосомы взаимодействуя с данным белком образуют трансляционно не активный 100S димер. В этой фазе бактериальные клетки устойчивы к внешним стресс условиям, что обеспечивает их резистентность к антимикробным агентам. Структура данного белка на данный момент не известна.
В результате проделанной работы были получены следующие результаты:
-Найдены подходящие условия экспрессии белка для исследования методом спектроскопии ЯМР.
-Спектры, полученные в ходе работы, были обработаны и проведено отнесение сигналов ЯМР ядер 1H, 13С и 15N аминокислотных остатков из основной белковой цепи С-домена белка SaHPF. Показано, что в структуре С-домена белка в растворе присутствуют элементы вторичной структуры в виде Р-складки: Pi (133-135 остаток), р2 (160-164 остаток), р3 (171-175 остаток), р4 (182-187 остаток) и а-спирали (146-156 остаток).
Следующим этапом по установлению структуры являются эксперименты по ядерному эффекту Оверхаузера (ЯЭО), которые позволят определить взаимодействующие через пространства ядра из различных частей молекулы. На основе полученных расстояний будет рассчитана структура исследуемой молекулы.
-Найдены подходящие условия экспрессии белка для исследования методом спектроскопии ЯМР.
-Спектры, полученные в ходе работы, были обработаны и проведено отнесение сигналов ЯМР ядер 1H, 13С и 15N аминокислотных остатков из основной белковой цепи С-домена белка SaHPF. Показано, что в структуре С-домена белка в растворе присутствуют элементы вторичной структуры в виде Р-складки: Pi (133-135 остаток), р2 (160-164 остаток), р3 (171-175 остаток), р4 (182-187 остаток) и а-спирали (146-156 остаток).
Следующим этапом по установлению структуры являются эксперименты по ядерному эффекту Оверхаузера (ЯЭО), которые позволят определить взаимодействующие через пространства ядра из различных частей молекулы. На основе полученных расстояний будет рассчитана структура исследуемой молекулы.