📄Работа №76610
Тема: Исследование особенностей альфа 7 и альфа 9 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов методами сайт-направленного мутагенеза и флоуресцентной детекции кальция
Тип работы
Бакалаврская работа
Предмет
химия
Объем:
65 листов
Год:
2020
Просмотров:
93
4770
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
2. Введение 8
3. Литературный обзор 11
3.1. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) 11
3.2. Строение и функционирование нАХР 17
3.3. а7 нАХР и а9 нАХР 25
3.4. Мышечные нАХР 28
4. Заключение 32
5. Экспериментальная часть 33
5.1. Приборы и материалы 33
5.2. Точечный мутагенез нАХР 34
5.2.1. Подбор праймеров 34
5.2.2. ПЦР-амплификация 35
5.2.3. Электро форез 36
5.2.4. Экстракция плазмидной ДНК из агарозного геля 37
5.2.5. Трансформация клеток и посев на чашку Петри 37
5.2.6. ПЦР-скрининг колоний и наращивание в жидкой LB-среде 38
5.2.7. Выделение плазмидной ДНК 39
5.2.8. Секвенирование плазмидной ДНК 40
5.3. Флуоресцентная микроскопия и кальциевый имиджинг 41
5.3.1. Программное обеспечение 41
5.3.2. Флуоресцентная детекция цитоплазматического кальция 41
6. Обсуждение полученных результатов 48
7. Экономическая часть 50
7.1. Организация и планирование работ по теме 50
7.1.1. Организация работ 51
7.1.2. График проведения работ 53
7.2. Расчет стоимости проведения работ 54
7.2.1. Затраты на материалы и покупные изделия 55
7.2.2. Расчет затрат на спецоборудование 56
7.2.3. Расчет основной заработной платы персонала 56
7.2.4. Дополнительная заработная плата персонала 57
7.2.5. Страховые отчисления 57
7.2.6. Командировочные расходы 57
7.2.7. Контрагентские услуги 57
7.2.8. Накладные расходы 57
7.2.9. Прочие расходы 57
7.2.10. Полная себестоимость 58
8. Выводы 59
9. Список использованных источников
3. Литературный обзор 11
3.1. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) 11
3.2. Строение и функционирование нАХР 17
3.3. а7 нАХР и а9 нАХР 25
3.4. Мышечные нАХР 28
4. Заключение 32
5. Экспериментальная часть 33
5.1. Приборы и материалы 33
5.2. Точечный мутагенез нАХР 34
5.2.1. Подбор праймеров 34
5.2.2. ПЦР-амплификация 35
5.2.3. Электро форез 36
5.2.4. Экстракция плазмидной ДНК из агарозного геля 37
5.2.5. Трансформация клеток и посев на чашку Петри 37
5.2.6. ПЦР-скрининг колоний и наращивание в жидкой LB-среде 38
5.2.7. Выделение плазмидной ДНК 39
5.2.8. Секвенирование плазмидной ДНК 40
5.3. Флуоресцентная микроскопия и кальциевый имиджинг 41
5.3.1. Программное обеспечение 41
5.3.2. Флуоресцентная детекция цитоплазматического кальция 41
6. Обсуждение полученных результатов 48
7. Экономическая часть 50
7.1. Организация и планирование работ по теме 50
7.1.1. Организация работ 51
7.1.2. График проведения работ 53
7.2. Расчет стоимости проведения работ 54
7.2.1. Затраты на материалы и покупные изделия 55
7.2.2. Расчет затрат на спецоборудование 56
7.2.3. Расчет основной заработной платы персонала 56
7.2.4. Дополнительная заработная плата персонала 57
7.2.5. Страховые отчисления 57
7.2.6. Командировочные расходы 57
7.2.7. Контрагентские услуги 57
7.2.8. Накладные расходы 57
7.2.9. Прочие расходы 57
7.2.10. Полная себестоимость 58
8. Выводы 59
9. Список использованных источников
📖 Введение
Надсемейство пентамерных лиганд-управляемых ионных каналов (пЛУИК)
представляет собой группу трансмембранных рецепторов, обеспечивающих селективный пассивный транспорт ионов через плазматическую мембрану посредством изменения конформации при связывании с молекулами лигандов. Последние можно классифицировать по типу вызываемых ими изменений активности
рецептора на: агонисты, переводящие рецептор в активное состояние; антагонисты, блокирующие его; и аллостерические модуляторы, селективно регулирующие действие других лигандов. По строению пЛУИК представляют собой белковые комплексы из пяти субъединиц, симметрично расположенных вокруг центрального ионного канала. В каждой субъединице выделяют три функциональных домена: внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический. Надсемейство пЛУИК включает семейство Цис-петельных рецепторов, представителями которого являются никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР)
наряду с серотониновыми рецепторами (5-НТ3Р) и рецепторами γ-аминомасляной кислоты (ГАМКАР). Ключевой особенностью строения рецепторов данного
семейства является наличие пары цистеинов, расположенных во внеклеточном
домене и соединенных друг с другом посредством дисульфидной связи. нАХР
широко распространены по всему животному миру от нематод до человека и экспрессируются во многих областях центральной и периферической нервной системы, а также в глиальных, эпителиальных, эндотелиальных, дендритных и др.
клетках. К лигандам нАХР, как видно из названия, относят эндогенный ацетилхолин и экзогенный никотин. Вследствие широкой распространенности в организме и вовлеченности во многие физиологические процессы, нАХР являются
перспективной мишенью лекарственных средств при патологиях нервной и иммунной систем, в частности при болезни Альцгеймера, шизофрении, миастении,
эпилепсии и др. Гомопентамерные α7 нАХР представляют особый интерес, поскольку обладают уникальными свойствами: высокой проницаемостью для9
ионов кальция, высоким сродством к α-бунгаротоксину (α-BTX), относительно
низким сродством к никотину и быстрой десенситизацией. Мышечные нАХР,
наряду с α7 нАХР обладающие высоким сродством к α-BTX, играют важнейшую
роль в жизнедеятельности млекопитающих через обеспечение работы скелетной
мускулатуры. Мутации в генах субъединиц мышечного нАХР зачастую приводят к появлению редких генетических заболеваний — наследственных миастений. Наиболее интересными с точки зрения изучения фундаментальных механизмов функционирования нАХР являются миастении так называемых «медленных каналов». Этот тип наследственных миастений вызван мутациями, повышающими активность мышечного нАХР, что приводит к избыточному проникновению ионов кальция в мышечные волокна и повреждению мышечной ткани. Таким образом, исследование нАХР, проницаемых для ионов кальция и их мутантных форм является актуальной задачей, как с точки зрения фундаментальной
науки, так и для создания новых лекарственных средств.
Целью данной работы является исследование молекулярных механизмов
функционирования различных типов рецепторов, в частности с мутантными α7
и мышечными нАХР, с помощью сочетания методов сайт-направленного мутагенеза и кальциевого имиджинга.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) получить точечный мутант α7 нАХР с двойной заменой в участке связывания с лигандами на основе двух мутантов с одиночными заменами:
L119D и F209S;
2) исследовать функциональную активность мутантов мышечного рецептора на основе мутанта, ассоциированного с наследственной миастенией
медленных каналов.
представляет собой группу трансмембранных рецепторов, обеспечивающих селективный пассивный транспорт ионов через плазматическую мембрану посредством изменения конформации при связывании с молекулами лигандов. Последние можно классифицировать по типу вызываемых ими изменений активности
рецептора на: агонисты, переводящие рецептор в активное состояние; антагонисты, блокирующие его; и аллостерические модуляторы, селективно регулирующие действие других лигандов. По строению пЛУИК представляют собой белковые комплексы из пяти субъединиц, симметрично расположенных вокруг центрального ионного канала. В каждой субъединице выделяют три функциональных домена: внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический. Надсемейство пЛУИК включает семейство Цис-петельных рецепторов, представителями которого являются никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР)
наряду с серотониновыми рецепторами (5-НТ3Р) и рецепторами γ-аминомасляной кислоты (ГАМКАР). Ключевой особенностью строения рецепторов данного
семейства является наличие пары цистеинов, расположенных во внеклеточном
домене и соединенных друг с другом посредством дисульфидной связи. нАХР
широко распространены по всему животному миру от нематод до человека и экспрессируются во многих областях центральной и периферической нервной системы, а также в глиальных, эпителиальных, эндотелиальных, дендритных и др.
клетках. К лигандам нАХР, как видно из названия, относят эндогенный ацетилхолин и экзогенный никотин. Вследствие широкой распространенности в организме и вовлеченности во многие физиологические процессы, нАХР являются
перспективной мишенью лекарственных средств при патологиях нервной и иммунной систем, в частности при болезни Альцгеймера, шизофрении, миастении,
эпилепсии и др. Гомопентамерные α7 нАХР представляют особый интерес, поскольку обладают уникальными свойствами: высокой проницаемостью для9
ионов кальция, высоким сродством к α-бунгаротоксину (α-BTX), относительно
низким сродством к никотину и быстрой десенситизацией. Мышечные нАХР,
наряду с α7 нАХР обладающие высоким сродством к α-BTX, играют важнейшую
роль в жизнедеятельности млекопитающих через обеспечение работы скелетной
мускулатуры. Мутации в генах субъединиц мышечного нАХР зачастую приводят к появлению редких генетических заболеваний — наследственных миастений. Наиболее интересными с точки зрения изучения фундаментальных механизмов функционирования нАХР являются миастении так называемых «медленных каналов». Этот тип наследственных миастений вызван мутациями, повышающими активность мышечного нАХР, что приводит к избыточному проникновению ионов кальция в мышечные волокна и повреждению мышечной ткани. Таким образом, исследование нАХР, проницаемых для ионов кальция и их мутантных форм является актуальной задачей, как с точки зрения фундаментальной
науки, так и для создания новых лекарственных средств.
Целью данной работы является исследование молекулярных механизмов
функционирования различных типов рецепторов, в частности с мутантными α7
и мышечными нАХР, с помощью сочетания методов сайт-направленного мутагенеза и кальциевого имиджинга.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) получить точечный мутант α7 нАХР с двойной заменой в участке связывания с лигандами на основе двух мутантов с одиночными заменами:
L119D и F209S;
2) исследовать функциональную активность мутантов мышечного рецептора на основе мутанта, ассоциированного с наследственной миастенией
медленных каналов.
✅ Заключение
Была произведена мутация F209S в нАХР α7-го подтипа с мутацией
L119D. В процессе внесения мутации F209S произошла незапланированная дупликация участка «C»-петли, что произошло вследствие
наличия в «C»-петле повторяющихся нуклеотидных последовательностей.
2. Были обработаны данные кальциевого имиджинга мышечного нАХР
дикого типа (WT) и мутантных рецепторов при аппликации агониста
(ацетилхолина) в разных концентрациях. Исследование показало, что
при низких концентрациях ацетилхолина (10 мкМ) мутанты G173S,
L219T и L219A проявляют повышенную активность в сравнении с мышечным нАХР дикого типа (WT), а мутация L219A взаимодействует с
мутацией G173S (вызывающей миастению), что приводит к уменьшению чувствительности двойного мутанта и к низким, и к слишком высоким концентрациям ацетилхолина. Благодаря графикам падения интенсивности флуоресценции во времени было выявлено, что мутации в
положениях 173 и 219 мнАХР функционально и топологически взаимосвязаны.
L119D. В процессе внесения мутации F209S произошла незапланированная дупликация участка «C»-петли, что произошло вследствие
наличия в «C»-петле повторяющихся нуклеотидных последовательностей.
2. Были обработаны данные кальциевого имиджинга мышечного нАХР
дикого типа (WT) и мутантных рецепторов при аппликации агониста
(ацетилхолина) в разных концентрациях. Исследование показало, что
при низких концентрациях ацетилхолина (10 мкМ) мутанты G173S,
L219T и L219A проявляют повышенную активность в сравнении с мышечным нАХР дикого типа (WT), а мутация L219A взаимодействует с
мутацией G173S (вызывающей миастению), что приводит к уменьшению чувствительности двойного мутанта и к низким, и к слишком высоким концентрациям ацетилхолина. Благодаря графикам падения интенсивности флуоресценции во времени было выявлено, что мутации в
положениях 173 и 219 мнАХР функционально и топологически взаимосвязаны.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.