Исследование особенностей альфа 7 и альфа 9 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов методами сайт-направленного мутагенеза и флоуресцентной детекции кальция
Надсемейство пентамерных лиганд-управляемых ионных каналов (пЛУИК)
представляет собой группу трансмембранных рецепторов, обеспечивающих селективный пассивный транспорт ионов через плазматическую мембрану посредством изменения конформации при связывании с молекулами лигандов. Последние можно классифицировать по типу вызываемых ими изменений активности
рецептора на: агонисты, переводящие рецептор в активное состояние; антагонисты, блокирующие его; и аллостерические модуляторы, селективно регулирующие действие других лигандов. По строению пЛУИК представляют собой белковые комплексы из пяти субъединиц, симметрично расположенных вокруг центрального ионного канала. В каждой субъединице выделяют три функциональных домена: внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический. Надсемейство пЛУИК включает семейство Цис-петельных рецепторов, представителями которого являются никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР)
наряду с серотониновыми рецепторами (5-НТ3Р) и рецепторами γ-аминомасляной кислоты (ГАМКАР). Ключевой особенностью строения рецепторов данного
семейства является наличие пары цистеинов, расположенных во внеклеточном
домене и соединенных друг с другом посредством дисульфидной связи. нАХР
широко распространены по всему животному миру от нематод до человека и экспрессируются во многих областях центральной и периферической нервной системы, а также в глиальных, эпителиальных, эндотелиальных, дендритных и др.
клетках. К лигандам нАХР, как видно из названия, относят эндогенный ацетилхолин и экзогенный никотин. Вследствие широкой распространенности в организме и вовлеченности во многие физиологические процессы, нАХР являются
перспективной мишенью лекарственных средств при патологиях нервной и иммунной систем, в частности при болезни Альцгеймера, шизофрении, миастении,
эпилепсии и др. Гомопентамерные α7 нАХР представляют особый интерес, поскольку обладают уникальными свойствами: высокой проницаемостью для9
ионов кальция, высоким сродством к α-бунгаротоксину (α-BTX), относительно
низким сродством к никотину и быстрой десенситизацией. Мышечные нАХР,
наряду с α7 нАХР обладающие высоким сродством к α-BTX, играют важнейшую
роль в жизнедеятельности млекопитающих через обеспечение работы скелетной
мускулатуры. Мутации в генах субъединиц мышечного нАХР зачастую приводят к появлению редких генетических заболеваний — наследственных миастений. Наиболее интересными с точки зрения изучения фундаментальных механизмов функционирования нАХР являются миастении так называемых «медленных каналов». Этот тип наследственных миастений вызван мутациями, повышающими активность мышечного нАХР, что приводит к избыточному проникновению ионов кальция в мышечные волокна и повреждению мышечной ткани. Таким образом, исследование нАХР, проницаемых для ионов кальция и их мутантных форм является актуальной задачей, как с точки зрения фундаментальной
науки, так и для создания новых лекарственных средств.
Целью данной работы является исследование молекулярных механизмов
функционирования различных типов рецепторов, в частности с мутантными α7
и мышечными нАХР, с помощью сочетания методов сайт-направленного мутагенеза и кальциевого имиджинга.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) получить точечный мутант α7 нАХР с двойной заменой в участке связывания с лигандами на основе двух мутантов с одиночными заменами:
L119D и F209S;
2) исследовать функциональную активность мутантов мышечного рецептора на основе мутанта, ассоциированного с наследственной миастенией
медленных каналов.
Была произведена мутация F209S в нАХР α7-го подтипа с мутацией
L119D. В процессе внесения мутации F209S произошла незапланированная дупликация участка «C»-петли, что произошло вследствие
наличия в «C»-петле повторяющихся нуклеотидных последовательностей.
2. Были обработаны данные кальциевого имиджинга мышечного нАХР
дикого типа (WT) и мутантных рецепторов при аппликации агониста
(ацетилхолина) в разных концентрациях. Исследование показало, что
при низких концентрациях ацетилхолина (10 мкМ) мутанты G173S,
L219T и L219A проявляют повышенную активность в сравнении с мышечным нАХР дикого типа (WT), а мутация L219A взаимодействует с
мутацией G173S (вызывающей миастению), что приводит к уменьшению чувствительности двойного мутанта и к низким, и к слишком высоким концентрациям ацетилхолина. Благодаря графикам падения интенсивности флуоресценции во времени было выявлено, что мутации в
положениях 173 и 219 мнАХР функционально и топологически взаимосвязаны.
