Оценка статуса системы эксцизионной репарации оснований ДНК в экстрактах клеток голого землекопа
|
1. Список сокращений 5
2. Введение 6
3. Литературный обзор 8
3.1. Продолжительность жизни млекопитающих 8
3.2. Биологические особенности голого землекопа 9
3.3. Грызуны как модели для сравнительных исследований старения 12
3.4. Межвидовые сравнительные исследования, связанные с продолжительностью жизни и механизмами подавления опухолей 13
3.4.1. Теломерное поддержание и репликативное старение 13
3.4.2. Механизмы, контролирующие клеточную пролиферацию 14
3.4.3. Механизмы подавления опухолей 14
3.4.4. Стабильность генома 15
3.5. Репарация ДНК 16
3.5.1. Основные типы повреждений ДНК и пути репарации 16
3.5.2. Репарация ДНК и продолжительность жизни млекопитающих 19
3.5.3. Эксцизионная репарация оснований 21
4. Материалы и методы 26
4.1. Список материалов 26
4.2. Сравнение уровня мРНК в генах Parpl, Parp2, Apexl, Xrccl, Lig3и Polfiв клетках голого землекопа и домовой мыши методом кПЦР 26
4.2.1. Приготовление растворов для ПЦР 28
4.2.2. Построение стандартных кривых 28
4.2.3. Определение относительного уровня экспрессии генов в клетках голого землекопа и домовой мыши 29
4.3. Функциональные тесты на определение активности ферментов репарации ДНК с использованием в качестве субстратов ДНК-дуплексы содержащие dUMP 30
4.3.1. [32Р]-мечение олигонуклеотидов по 5’-концу 30
4.3.2. Приготовление ДНК-дуплексов, содержащих dUMP 30
4.3.3. Выделение цельноклеточных экстрактов из фибробластов голого землекопа и домовой мыши 31
4.3.4. Определение урацил-ДНК-гликозилазной активности клеточных экстрактов голого землекопа и домовой мыши 31
4.3.5. Получение ДНК-дуплексов, содержащих АП-сайт 31
4.3.6. Определение АП-эндонуклеазной активности клеточных экстрактов голого землекопа и домовой мыши 32
4.3.7. Приготовление ДНК-дуплекса, содержащего одноцепочечный разрыв с 5’-dRP и 3’-OH 32
4.3.8. Определение активности ДНК-полимеразы в в экстрактах клеток голого землекопа и домовой мыши 32
4.3.9. Определение флэп-эндонуклеазной активности в экстрактах клеток голого землекопа и домовой мыши 33
4.3.10. Определение ДНК-лигазной активности экстрактов клеток голого землекопа и домовой мыши 33
4.3.11. Синтез [32Р]-меченого NAD+ 33
4.3.12. Определение активности PARP в экстрактах клеток голого землекопа и домовой мыши 34
5. Результаты и их обсуждение 35
5.1. Сравнение относительного уровня экспрессии генов Apexl, Xrccl, Lig3, Polfi, Parpl, Parp2 в клетках голого землекопа и домовой мыши 35
5.2. Определение активности ферментов эксцизионной репарации ДНК с использованием экстрактов клеток голого землекопа и домовой мыши, облученных УФ 38
5.2.1. Сравнение урацил-ДНК-гликозилазной активности экстрактов клеток голого землекопа и домовой мыши 38
5.2.2. Сравнение АП-эндонуклеазной активности экстрактов клеток голого землекопа и домовой мыши 39
5.3. Определение активности ферментов эксцизионной репарации ДНК с
использованием дуплексов, имитирующих кластерные повреждения 40
5.3.1. Эффективность выщепления урацила из ДНК-дуплексов в клеточных экстрактах голого землекопа и домовой мыши в моделях кластерных повреждений ..41
5.3.2. Эффективность расщепления АП-сайтов в экстрактах клеток голого землекопа и домовой мыши 42
5.3.3. ДНК-полимеразная активность клеточных экстрактов голого землекопа и домовой мыши 44
5.3.4. Флэп-эндонуклеазная активность клеточных экстрактов голого землекопа и домовой мыши 45
5.3.5. ДНК-лигазная активность экстрактов клеток голого землекопа и домовой мыши 47
5.3.6. Эффективность поли(АДФ-рибозил)ирования клеточных экстрактов голого землекопа и домовой мыши 48
6. Выводы 50
7. Список литературы 51
2. Введение 6
3. Литературный обзор 8
3.1. Продолжительность жизни млекопитающих 8
3.2. Биологические особенности голого землекопа 9
3.3. Грызуны как модели для сравнительных исследований старения 12
3.4. Межвидовые сравнительные исследования, связанные с продолжительностью жизни и механизмами подавления опухолей 13
3.4.1. Теломерное поддержание и репликативное старение 13
3.4.2. Механизмы, контролирующие клеточную пролиферацию 14
3.4.3. Механизмы подавления опухолей 14
3.4.4. Стабильность генома 15
3.5. Репарация ДНК 16
3.5.1. Основные типы повреждений ДНК и пути репарации 16
3.5.2. Репарация ДНК и продолжительность жизни млекопитающих 19
3.5.3. Эксцизионная репарация оснований 21
4. Материалы и методы 26
4.1. Список материалов 26
4.2. Сравнение уровня мРНК в генах Parpl, Parp2, Apexl, Xrccl, Lig3и Polfiв клетках голого землекопа и домовой мыши методом кПЦР 26
4.2.1. Приготовление растворов для ПЦР 28
4.2.2. Построение стандартных кривых 28
4.2.3. Определение относительного уровня экспрессии генов в клетках голого землекопа и домовой мыши 29
4.3. Функциональные тесты на определение активности ферментов репарации ДНК с использованием в качестве субстратов ДНК-дуплексы содержащие dUMP 30
4.3.1. [32Р]-мечение олигонуклеотидов по 5’-концу 30
4.3.2. Приготовление ДНК-дуплексов, содержащих dUMP 30
4.3.3. Выделение цельноклеточных экстрактов из фибробластов голого землекопа и домовой мыши 31
4.3.4. Определение урацил-ДНК-гликозилазной активности клеточных экстрактов голого землекопа и домовой мыши 31
4.3.5. Получение ДНК-дуплексов, содержащих АП-сайт 31
4.3.6. Определение АП-эндонуклеазной активности клеточных экстрактов голого землекопа и домовой мыши 32
4.3.7. Приготовление ДНК-дуплекса, содержащего одноцепочечный разрыв с 5’-dRP и 3’-OH 32
4.3.8. Определение активности ДНК-полимеразы в в экстрактах клеток голого землекопа и домовой мыши 32
4.3.9. Определение флэп-эндонуклеазной активности в экстрактах клеток голого землекопа и домовой мыши 33
4.3.10. Определение ДНК-лигазной активности экстрактов клеток голого землекопа и домовой мыши 33
4.3.11. Синтез [32Р]-меченого NAD+ 33
4.3.12. Определение активности PARP в экстрактах клеток голого землекопа и домовой мыши 34
5. Результаты и их обсуждение 35
5.1. Сравнение относительного уровня экспрессии генов Apexl, Xrccl, Lig3, Polfi, Parpl, Parp2 в клетках голого землекопа и домовой мыши 35
5.2. Определение активности ферментов эксцизионной репарации ДНК с использованием экстрактов клеток голого землекопа и домовой мыши, облученных УФ 38
5.2.1. Сравнение урацил-ДНК-гликозилазной активности экстрактов клеток голого землекопа и домовой мыши 38
5.2.2. Сравнение АП-эндонуклеазной активности экстрактов клеток голого землекопа и домовой мыши 39
5.3. Определение активности ферментов эксцизионной репарации ДНК с
использованием дуплексов, имитирующих кластерные повреждения 40
5.3.1. Эффективность выщепления урацила из ДНК-дуплексов в клеточных экстрактах голого землекопа и домовой мыши в моделях кластерных повреждений ..41
5.3.2. Эффективность расщепления АП-сайтов в экстрактах клеток голого землекопа и домовой мыши 42
5.3.3. ДНК-полимеразная активность клеточных экстрактов голого землекопа и домовой мыши 44
5.3.4. Флэп-эндонуклеазная активность клеточных экстрактов голого землекопа и домовой мыши 45
5.3.5. ДНК-лигазная активность экстрактов клеток голого землекопа и домовой мыши 47
5.3.6. Эффективность поли(АДФ-рибозил)ирования клеточных экстрактов голого землекопа и домовой мыши 48
6. Выводы 50
7. Список литературы 51
Вопрос о том, какие процессы в живых организмах ведут к старению и последующей смерти, волнует человечество долгое время. Некоторые виды животных эволюционировали таким образом, что в результате имеют высокую продолжительность жизни и замедленное старение. Одним из таких видов является голый землекоп (Heterocephalus glaber),который представляет огромный интерес для научного сообщества ввиду того, что имеет продолжительность жизни, превышающую продолжительность жизни других грызунов аналогичного размера примерно в 8 раз. При этом эти животные показывают низкую предрасположенность к раку и менее выраженные признаки старения, которые наблюдаются у других животных с увеличением возраста.
Так как одной из наиболее естественных причин старения и возникновения рака являются повреждения ДНК и мутации, которые являются результатом этих повреждений, поддержание целостности генома является одним из важнейших факторов, определяющих продолжительность жизни. Геном в клетках живых организмов поддерживается в целостности с помощью репарации ДНК, поэтому эти процессы являются значимыми для высокой продолжительности жизни, а гены, кодирующие белки, участвующие в репарации ДНК, являются объектами повышенного интереса для исследований в этой области.
В данной работе мы сфокусировали свое внимание на изменении уровня экспрессии генов, кодирующих ряд ключевых белков эксцизионной репарации оснований ДНК, в клетках голого землекопа, а также на эффективности функционирования белков этой системы в сравнении с клетками домовой мыши.
Цель работы:
провести сравнительный анализ статуса системы эксцизионной репарации оснований ДНК в клетках голого землекопа (Heterocephalus glaber)и домовой мыши (Mus musculus).
Задачи:
1. Оценить уровень мРНК генов Parpl, Parp2, Apexl, Xrccl, Lig3и Polfiв клетках голого землекопа и домовой мыши после обработки УФ-излучением;
2. При помощи функциональных тестов сравнить активность ключевых ферментов, участвующих в эксцизионной репарации оснований, в экстрактах клеток голого землекопа и домовой мыши.
Дипломником была проведена вся экспериментальная часть, описанная в работе, с обработкой результатов. Использованные в работе тотальные РНК из фибробластов голого землекопа и домовой мыши были предоставлены сотрудниками лаборатории биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН, культуры клеток были выращены в ИМКБ СО РАН, там же были проведены операции по их облучению УФ. Все олигонуклеотиды, использованные в работе, были синтезированы в лаборатории биомедицинской химии ИХБФМ СО РАН. [y-32P]-ATP и [a-32P]-ATP для радиоактивного мечения олигонуклеотидов и NAD+ были синтезированы в лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН. Ферменты, использованные в работе, вместе с буферными компонентами, были предоставлены сотрудниками лаборатории биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН. Обсуждение результатов работы проводилось с Кутузовым М. М.
Так как одной из наиболее естественных причин старения и возникновения рака являются повреждения ДНК и мутации, которые являются результатом этих повреждений, поддержание целостности генома является одним из важнейших факторов, определяющих продолжительность жизни. Геном в клетках живых организмов поддерживается в целостности с помощью репарации ДНК, поэтому эти процессы являются значимыми для высокой продолжительности жизни, а гены, кодирующие белки, участвующие в репарации ДНК, являются объектами повышенного интереса для исследований в этой области.
В данной работе мы сфокусировали свое внимание на изменении уровня экспрессии генов, кодирующих ряд ключевых белков эксцизионной репарации оснований ДНК, в клетках голого землекопа, а также на эффективности функционирования белков этой системы в сравнении с клетками домовой мыши.
Цель работы:
провести сравнительный анализ статуса системы эксцизионной репарации оснований ДНК в клетках голого землекопа (Heterocephalus glaber)и домовой мыши (Mus musculus).
Задачи:
1. Оценить уровень мРНК генов Parpl, Parp2, Apexl, Xrccl, Lig3и Polfiв клетках голого землекопа и домовой мыши после обработки УФ-излучением;
2. При помощи функциональных тестов сравнить активность ключевых ферментов, участвующих в эксцизионной репарации оснований, в экстрактах клеток голого землекопа и домовой мыши.
Дипломником была проведена вся экспериментальная часть, описанная в работе, с обработкой результатов. Использованные в работе тотальные РНК из фибробластов голого землекопа и домовой мыши были предоставлены сотрудниками лаборатории биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН, культуры клеток были выращены в ИМКБ СО РАН, там же были проведены операции по их облучению УФ. Все олигонуклеотиды, использованные в работе, были синтезированы в лаборатории биомедицинской химии ИХБФМ СО РАН. [y-32P]-ATP и [a-32P]-ATP для радиоактивного мечения олигонуклеотидов и NAD+ были синтезированы в лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН. Ферменты, использованные в работе, вместе с буферными компонентами, были предоставлены сотрудниками лаборатории биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН. Обсуждение результатов работы проводилось с Кутузовым М. М.
1. Методом ОТ-ПЦР показано, что уровень мРНК генов ряда ключевых белков системы эксцизионной репарации оснований ДНК (Parpl, Parp2, Apexl, Xrccl, Lig3и Polp)меняется незначительно в ответ на УФ-облучение клеток голого землекопа (Heterocephalus glaber)и домовой мыши (Mus musculus).
2. С использованием функциональных тестов установлено, что:
- урацил-ДНК-гликозилазная активность после УФ-облучения в экстрактах клеток голого землекопа выше в сравнении с экстрактами клеток домовой мыши;
- в экстрактах клеток голого землекопа эксцизионная репарация оснований протекает преимущественно по короткозаплаточному пути, в то время как в экстрактах клеток домовой мыши преимущественно реализуется длиннозаплаточный путь;
- поли(АДФ-рибозил)ирование протекает в 4,0±О,5 раза эффективнее в экстрактах клеток голого землекопа, чем в экстрактах клеток домовой мыши.
2. С использованием функциональных тестов установлено, что:
- урацил-ДНК-гликозилазная активность после УФ-облучения в экстрактах клеток голого землекопа выше в сравнении с экстрактами клеток домовой мыши;
- в экстрактах клеток голого землекопа эксцизионная репарация оснований протекает преимущественно по короткозаплаточному пути, в то время как в экстрактах клеток домовой мыши преимущественно реализуется длиннозаплаточный путь;
- поли(АДФ-рибозил)ирование протекает в 4,0±О,5 раза эффективнее в экстрактах клеток голого землекопа, чем в экстрактах клеток домовой мыши.