📄Работа №76486
Тема: Деплеция линкерных гистонов Н1 из хроматина под влиянием растительных ДНК-тропных полифенолов
Характеристики работы
Тип работы
Дипломные работы, ВКР
Предмет
Биотехнология
Объем:
62 листов
Год:
2020
Просмотров:
146
4345
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
Список сокращений 4
Введение 5
1. Обзор литературы 9
1.1. Растительные полифенолы 9
1.2. Организация хроматина 19
2. Результаты работы и их обсуждение 30
3. Экспериментальная часть 47
4. Заключение 52
5. Список литературы 54
6. Апробация результатов исследования
Введение 5
1. Обзор литературы 9
1.1. Растительные полифенолы 9
1.2. Организация хроматина 19
2. Результаты работы и их обсуждение 30
3. Экспериментальная часть 47
4. Заключение 52
5. Список литературы 54
6. Апробация результатов исследования
📖 Введение
В регионах с различными условиями и образом жизни наблюдается различный спектр злокачественных опухолей, что даёт основания считать образ жизни одним из существенных факторов, влияющих на появление и развитие онкологических заболеваний. Это подтверждается и данными об изменении профиля онкологической заболеваемости у мигрантов [1]. В частности, общий характер питания коррелирует с различными группами онкологических заболеваний, однако в эпидемиологических исследованиях оценка влияния отдельных компонентов питания весьма затруднительна [2]. В связи с этим представляется конструктивным экспериментальное изучение механизмов действия ксенобиотиков - соединений, поступающих в клетки организма из окружающей среды, которые обладают антиканцерогенными свойствами. Такими соединениями, в частности, являются фитонутриенты - вторичные метаболиты растений.
Фитонутриенты играют большую роль в жизнедеятельности растений, и их основной функцией является защита растений от агрессивного воздействия внешнего мира, такого как ультрафиолетовое излучение, фотосинтетический стресс, температурные колебания окружающей среды и т.д. Биологическая активность и польза этих веществ была обнаружена людьми ещё c древних времён, и, как следствие, начала развиваться народная медицина, основанная на лечении травами и использовании различных диет. Фитотерапия была известна уже древним шумерам около 5000 лет назад: были найдены их таблички со списками сотен лекарственных растений, таких как мирра и опиум. А в Древней Греции, например, люди заметили лечебные свойства листьев ивы, в которых содержится ацетилсалициловая кислота, и делали из них настойки в качестве жаропонижающего лекарства. В Средние Века травничество было очень распространенно у монахов, которые в свободное время занимались систематизацией накопленных человечеством знаний и выращиванием лекарственных трав в монастырях. Таким образом, монастыри были центром медицинских знаний, а их сады - источником лекарств от простых заболеваний [3]. И лишь в конце 19-го - начале 20-го века учёные впервые смогли выделить активные вещества из экстрактов растений (салициловую кислоту, морфин и т.д.), установить их химический состав и доказать их лечебные свойства. Например, салициловая кислота была открыта и извлечена из сухих листьев таволги в 1897 году Артуром Айхенгрином и Феликсом Хоффманом и была модифицирована в ацетилсалициловую кислоту, которая всем больше известна как аспирин. Проведя клинические испытания, в том числе и на себе, Айхенгрин доказал анальгетическое и жаропонижающее свойство аспирина [4]. С этих пор метаболитам растений стало уделяться больше внимания.
По данным исследований, фитонутриенты могут непосредственно взаимодействовать с различными биомолекулами клетки, в том числе с ДНК и белками, важным элементом взаимодействия которых является регуляция функционирования генома. Это взаимодействие позволяет влиять на структуру хроматина, непосредственно путем изменения физико-химических характеристик ДНК, а также опосредованно через эпигенетическую регуляцию и влияние на белки-шапероны, что в конечном итоге изменяет экспрессию различных генов, а значит и в целом процессы жизнедеятельности клеток. В то же время для большой группы фитонутриентов - растительных полифенолов, были выявлены антиканцерогенные свойства в экспериментах на животных с химически индуцированными опухолями легкого, кишечника, молочной железы и других. Для большинства из них были отмечены значительные уменьшения скорости роста и размера опухолей, также отмечено активное ингибирование прогрессии опухолей и снижение частоты их образования. До настоящего времени ДНК-опосредованные механизмы действия растительных полифенолов на эукариотические клетки остаются невыясненными, в связи с чем исследование воздействия ряда данных соединений на структуру хроматина актуально для экспериментальной онкологии как в плане понимания закономерностей регуляции структуры хроматина, так и для совершенствования подходов к профилактике рака [5].
В данной работе в качестве объекта исследования выбраны такие растительные полифенолы как эпигаллакатехина галлат, кемпферол, апигенин и тимохинон, для которых накоплены убедительные данные об антиканцерогенном действии.
Одним из возможных ДНК-опосредованных механизмов действия полифенолов может быть их влияние на процессы компактизации ДНК, которые во многом определяются функционированием линкерных гистонов. Эти белки обеспечивают стабилизацию нуклеосом и участвуют в регуляции транскрипции, обеспечивая определенные изменения в профиле экспрессии генов. В частности, нок-даун вариантов линкерных гистонов Н1.2 и Н1.4, сопровождаемый снижением их содержания в хроматиновой фракции приводит к повышению экспрессии некодирующих РНК, что вызывает активацию интерферонового сигналинга 1 типа, препятствующего процессам канцерогенеза. Процесс компактизации ДНК важен для реализации клеточного деления, т.к. его нарушение может приводить к остановке клеточного цикла в S-фазе.
В связи с вышесказанным, целью представленной работы является исследование влияния ряда ДНК-тропных растительных полифенолов на локализацию линкерного гистона H1 в клетках линии HeLa и на распределение популяции этих клеток по фазам клеточного цикла.
Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:
1. Определить максимально нетоксичную концентрацию каждого из исследуемых соединений в отношении клеток линии HeLa методом МТТ- теста;
2. Изучить влияние соединений на локализацию двух вариантов линкерного гистона H1: H1.2 и H1.4 в хроматин-связанной и нуклеоплазматической фракциях клеток HeLa методом Вестерн-блоттинга:
- оценить дозозависимость эффекта при использовании максимально нетоксичной концентрации и ингибирующей метаболическую активность клеток на 20% для всех анализируемых соединений;
- определить зависимость эффекта от продолжительности экспозиции клеток к полифенолам.
3. Оценить влияние анализируемых соединений на прохождение клетками HeLa клеточного цикла с помощью проточной цитофлуориметрии
Фитонутриенты играют большую роль в жизнедеятельности растений, и их основной функцией является защита растений от агрессивного воздействия внешнего мира, такого как ультрафиолетовое излучение, фотосинтетический стресс, температурные колебания окружающей среды и т.д. Биологическая активность и польза этих веществ была обнаружена людьми ещё c древних времён, и, как следствие, начала развиваться народная медицина, основанная на лечении травами и использовании различных диет. Фитотерапия была известна уже древним шумерам около 5000 лет назад: были найдены их таблички со списками сотен лекарственных растений, таких как мирра и опиум. А в Древней Греции, например, люди заметили лечебные свойства листьев ивы, в которых содержится ацетилсалициловая кислота, и делали из них настойки в качестве жаропонижающего лекарства. В Средние Века травничество было очень распространенно у монахов, которые в свободное время занимались систематизацией накопленных человечеством знаний и выращиванием лекарственных трав в монастырях. Таким образом, монастыри были центром медицинских знаний, а их сады - источником лекарств от простых заболеваний [3]. И лишь в конце 19-го - начале 20-го века учёные впервые смогли выделить активные вещества из экстрактов растений (салициловую кислоту, морфин и т.д.), установить их химический состав и доказать их лечебные свойства. Например, салициловая кислота была открыта и извлечена из сухих листьев таволги в 1897 году Артуром Айхенгрином и Феликсом Хоффманом и была модифицирована в ацетилсалициловую кислоту, которая всем больше известна как аспирин. Проведя клинические испытания, в том числе и на себе, Айхенгрин доказал анальгетическое и жаропонижающее свойство аспирина [4]. С этих пор метаболитам растений стало уделяться больше внимания.
По данным исследований, фитонутриенты могут непосредственно взаимодействовать с различными биомолекулами клетки, в том числе с ДНК и белками, важным элементом взаимодействия которых является регуляция функционирования генома. Это взаимодействие позволяет влиять на структуру хроматина, непосредственно путем изменения физико-химических характеристик ДНК, а также опосредованно через эпигенетическую регуляцию и влияние на белки-шапероны, что в конечном итоге изменяет экспрессию различных генов, а значит и в целом процессы жизнедеятельности клеток. В то же время для большой группы фитонутриентов - растительных полифенолов, были выявлены антиканцерогенные свойства в экспериментах на животных с химически индуцированными опухолями легкого, кишечника, молочной железы и других. Для большинства из них были отмечены значительные уменьшения скорости роста и размера опухолей, также отмечено активное ингибирование прогрессии опухолей и снижение частоты их образования. До настоящего времени ДНК-опосредованные механизмы действия растительных полифенолов на эукариотические клетки остаются невыясненными, в связи с чем исследование воздействия ряда данных соединений на структуру хроматина актуально для экспериментальной онкологии как в плане понимания закономерностей регуляции структуры хроматина, так и для совершенствования подходов к профилактике рака [5].
В данной работе в качестве объекта исследования выбраны такие растительные полифенолы как эпигаллакатехина галлат, кемпферол, апигенин и тимохинон, для которых накоплены убедительные данные об антиканцерогенном действии.
Одним из возможных ДНК-опосредованных механизмов действия полифенолов может быть их влияние на процессы компактизации ДНК, которые во многом определяются функционированием линкерных гистонов. Эти белки обеспечивают стабилизацию нуклеосом и участвуют в регуляции транскрипции, обеспечивая определенные изменения в профиле экспрессии генов. В частности, нок-даун вариантов линкерных гистонов Н1.2 и Н1.4, сопровождаемый снижением их содержания в хроматиновой фракции приводит к повышению экспрессии некодирующих РНК, что вызывает активацию интерферонового сигналинга 1 типа, препятствующего процессам канцерогенеза. Процесс компактизации ДНК важен для реализации клеточного деления, т.к. его нарушение может приводить к остановке клеточного цикла в S-фазе.
В связи с вышесказанным, целью представленной работы является исследование влияния ряда ДНК-тропных растительных полифенолов на локализацию линкерного гистона H1 в клетках линии HeLa и на распределение популяции этих клеток по фазам клеточного цикла.
Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:
1. Определить максимально нетоксичную концентрацию каждого из исследуемых соединений в отношении клеток линии HeLa методом МТТ- теста;
2. Изучить влияние соединений на локализацию двух вариантов линкерного гистона H1: H1.2 и H1.4 в хроматин-связанной и нуклеоплазматической фракциях клеток HeLa методом Вестерн-блоттинга:
- оценить дозозависимость эффекта при использовании максимально нетоксичной концентрации и ингибирующей метаболическую активность клеток на 20% для всех анализируемых соединений;
- определить зависимость эффекта от продолжительности экспозиции клеток к полифенолам.
3. Оценить влияние анализируемых соединений на прохождение клетками HeLa клеточного цикла с помощью проточной цитофлуориметрии
✅ Заключение
Представленное исследование было направлено на изучение ДНК- опосредованных эффектов растительных полифенолов, а именно, на анализ влияния малых природных ДНК-тропных молекул на локализацию линкерного гистона Н1 и на распределение популяции культивируемых клеток HeLa по фазам клеточного цикла. С помощью МТТ -теста были определены максимально нетоксичные концентрации растительных полифенолов, которые далее были использованы при изучении ДНК-опосредованных эффектов этих соединений. Ряд полученных в исследовании результатов свидетельствуют о правильности выдвинутой нами гипотезы о возможном влиянии растительных полифенолов на структуру хроматина путем вытеснения из хроматиновой фракции линкерных гистонов. Учитывая роль линкерных гистонов в процессе компактизации ДНК, важном для прохождения клеточного цикла, мы оценили влияние анализируемых полифенолов на распределение популяции культивируемых клеток HeLa по фазам клеточного цикла, однако значимых эффектов полифенолов в качестве блокаторов клеточного цикла не наблюдалось. Все полученные данные хорошо согласуются с опубликованными результатами исследований механизмов действия нового антиканцерогенного и противоопухолевого препарата кураксин CBL0137, который, так же как и растительные полифенолы, относится к малым ДНК-тропным молекулам.
Таким образом, все задачи, необходимые для достижения цели исследования выполнены полностью.
Полученные данные позволяют сделать следующие выводы:
1. Обработка клеток HeLa растительными полифенолами кемпферол и EGCG при использовании максимально нетоксичных концентраций вызывает статистически значимое снижение количества линкерных гистонов H1.2 и H1.4 в хроматин-связанной фракции.
2. Тенденция к снижению количества линкерных гистонов H1.2 и H1.4 в хроматин-связанной фракции клеток HeLa наблюдается при их обработке тимохиноном и апигенином, использованных в максимально нетоксичной концентрации (для подтверждения статистической значимости наблюдаемых эффектов необходимо проведение дополнительной серии экспериментов).
3. Различия в интенсивности снижения содержания линкерных гистонов Н1.2 и Н1.4 в хроматинсвязанной фракции клеток HeLa наблюдаются при действии всех анализируемых растительных полифенолов.
4. Для каждого из анализируемых растительных полифенолов динамика развития эффекта на содержание линкерных гистонов Н1.2 и Н1.4 в хроматин-связанной фракции клеток HeLa имеет особые временные зависимости; быстрее всего проявление эффекта происходит при действии кемпферола, для которого уже через 1 час обработки наблюдается снижение содержание линкерных гистонов в хроматин-связанной фракции на 65%.
5. Ни одно из анализируемых соединений не проявляет способности к блокированию прохождения клетками HeLa клеточного цикла, что было продемонстрировано как на несинхронизированной клеточной популяции, так и на популяциях клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла.
Таким образом, все задачи, необходимые для достижения цели исследования выполнены полностью.
Полученные данные позволяют сделать следующие выводы:
1. Обработка клеток HeLa растительными полифенолами кемпферол и EGCG при использовании максимально нетоксичных концентраций вызывает статистически значимое снижение количества линкерных гистонов H1.2 и H1.4 в хроматин-связанной фракции.
2. Тенденция к снижению количества линкерных гистонов H1.2 и H1.4 в хроматин-связанной фракции клеток HeLa наблюдается при их обработке тимохиноном и апигенином, использованных в максимально нетоксичной концентрации (для подтверждения статистической значимости наблюдаемых эффектов необходимо проведение дополнительной серии экспериментов).
3. Различия в интенсивности снижения содержания линкерных гистонов Н1.2 и Н1.4 в хроматинсвязанной фракции клеток HeLa наблюдаются при действии всех анализируемых растительных полифенолов.
4. Для каждого из анализируемых растительных полифенолов динамика развития эффекта на содержание линкерных гистонов Н1.2 и Н1.4 в хроматин-связанной фракции клеток HeLa имеет особые временные зависимости; быстрее всего проявление эффекта происходит при действии кемпферола, для которого уже через 1 час обработки наблюдается снижение содержание линкерных гистонов в хроматин-связанной фракции на 65%.
5. Ни одно из анализируемых соединений не проявляет способности к блокированию прохождения клетками HeLa клеточного цикла, что было продемонстрировано как на несинхронизированной клеточной популяции, так и на популяциях клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.