Липидный состав и мембранные характеристики клеток корней пшеницы при действии мембранотропных веществ
|
ВВЕДЕНИЕ 9
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1 Биологическая мембрана: химический состав, функции и структурная
организация 12
1.2 Методы исследования физико-химического состояния биологических
мембран 16
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 29
2.1 Характеристика материалов и реактивов 29
2.2 Выращивание проростков пшеницы 29
2.3 Экстрагирование липидов из корней пшеницы 30
2.4 Определение состава и содержания липидов в экстрактах из корней пшеницы с применением инструментальной тонкослойной хроматографии 31
2.5 Определение проницаемости и фазового состояния мембран клеток
корней пшеницы 40
2.6 Общие методы исследования 40
2.6.1 Инструментальная тонкослойная хроматография 40
2.6.2 Определение выхода электролитов и индекса мембранной
стабильности 41
2.6.3 Определение величины генерализационной поляризации
возбуждения флуоресценции липофильного зонда лаурдана в мембранах
микросомальной фракции растительных клеток 41
2.7 Статистическая обработка результатов 42
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ43
3.1 Обоснование исследования 43
3.2 Исследование влияния мембранотропных веществ на проницаемость
мембран клеток корней пшеницы 44
3.3 Исследование липидного профиля в экстрактах из клеток корней
пшеницы, выращенных при действии мембранотропных веществ 46
3.4 Исследование влияния мембранотропных веществ на характеристики мембран клеток корней пшеницы 56
ВЫВОДЫ 58
Список использованной литературы 59
Приложение 66
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1 Биологическая мембрана: химический состав, функции и структурная
организация 12
1.2 Методы исследования физико-химического состояния биологических
мембран 16
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 29
2.1 Характеристика материалов и реактивов 29
2.2 Выращивание проростков пшеницы 29
2.3 Экстрагирование липидов из корней пшеницы 30
2.4 Определение состава и содержания липидов в экстрактах из корней пшеницы с применением инструментальной тонкослойной хроматографии 31
2.5 Определение проницаемости и фазового состояния мембран клеток
корней пшеницы 40
2.6 Общие методы исследования 40
2.6.1 Инструментальная тонкослойная хроматография 40
2.6.2 Определение выхода электролитов и индекса мембранной
стабильности 41
2.6.3 Определение величины генерализационной поляризации
возбуждения флуоресценции липофильного зонда лаурдана в мембранах
микросомальной фракции растительных клеток 41
2.7 Статистическая обработка результатов 42
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ43
3.1 Обоснование исследования 43
3.2 Исследование влияния мембранотропных веществ на проницаемость
мембран клеток корней пшеницы 44
3.3 Исследование липидного профиля в экстрактах из клеток корней
пшеницы, выращенных при действии мембранотропных веществ 46
3.4 Исследование влияния мембранотропных веществ на характеристики мембран клеток корней пшеницы 56
ВЫВОДЫ 58
Список использованной литературы 59
Приложение 66
Актуальность. Различные неблагоприятные факторы окружающей среды воздействуют на растения вызывают в них стресс, что приводят к нарушениям жизнедеятельности растений. Липиды - это один из важных классов биологических соединений, который претерпевает существенные изменения в ответе растения на стрессовые воздействия [1]. Известно, что результатом стрессового воздействия на растение являются изменения метаболических процессов, идущих в клетке: активация ферментной системы, изменение текучести мембран, фотосинтетической способности [2]. Изучение этих изменений имеет важное фундаментальное значение, в первую очередь для культур, имеющих важное сельскохозяйственное значение. К важнейшим сельскохозяйственным культурам относится пшеница. Несмотря на широкую изученность пшеницы как основной продовольственной культуры, данные о ее липидном профиле, в том числе изменении его состава, при воздействии различных стрессоров до сих пор ограничены.
Целью настоящего исследования явилось изучение взаимосвязи состава липидов в корнях проростков пшеницы Triticum aestivum L.с проницаемостью клеточных мембран и их фазового состояния при действии мембранотропных веществ.
В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи:
1) определить проницаемость мембран клеток корней проростков, выращенных на средах с добавлением мембранотропных веществ, для электролитов путем оценки их выхода методом кондуктометрии;
2) исследовать липидный профиль в корнях проростков, выращенных на средах с добавлением мембранотропных веществ, методом инструментальной тонкослойной хроматографии на лабораторном комплексе «CAMAG» (Швейцария);
3) оценить величину генерализованной поляризации возбуждения флуоресценции липофильного зонда лаурдана в мембранах микросомальной
фракции клеток корней проростков пшеницы, выращенных на средах с добавлением мембранотропных веществ.
Научная новизна.
Впервые исследован качественный состав липидных соединений и определенно их количество в корнях проростков пшеницы, выращенных при воздействии СаС12(10-3 М) и Д-ситостерин (5*10-4 М), уплотняющих мембрану, а также нистатина (10-4 М) и детергента тритон Х-100 (1,6-10-5 М), которые увеличивают ее проницаемость.
Показано, что при выращивании пшеницы на среде с добавлением Д- ситостерина происходит существенное изменение состава липидов в клетках корней. Происходит увеличением стеринов и моногалактозилдиацилгрицерида (в 3,4 и 2 раза, соответственно) и снижение фосфатидилхолина и гликоцерамидов (1,4 и 2, соответственно) При этом обнаруженные изменения в липидном профиле влияют на мембранные характеристики клеток корней пшеницы - увеличение мембранной стабильности на 4,7 % и уплотнение мембран в 1,3 раза.
Установлено, что при выращивании растений в течение 4 суток на среде с добавлением нистатина в концентрации 10-4 М, происходит адаптация растений к данному мембранотропу, которая заключается в восстановлении мембранных характеристик - текучести и проницаемости. Одним из факторов в этом механизме адаптации является снижение (в 3,3 раза) количества в мембранах доли стеринов.
Практическая значимость.
Методические разработки и данные представленные в диссертации Белкиной А. В. имеют научно-прикладную значимость и могут быть использованы в исследовательских и образовательных учреждений.
По результатам исследования опубликованы 1 статья и 3 тезиса доклада: в материалах: II международного симпозиума «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Уфа, 2017), IV российского симпозиума с международным участием «Фитоиммунитет и клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2016), годичного собрания общества физиологов растений России «Экспериментальная биология растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Судак, 2017).
Часть результатов работы получена в лаборатории Окислительно - восстановительного метаболизма КИББ ФИЦ КазНЦ РАН.
Автор выражает благодарность соавторам за помощь в проведении экспериментов и обсуждении полученных результатов.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ (№ 16 - 04 - 00676 А).
Целью настоящего исследования явилось изучение взаимосвязи состава липидов в корнях проростков пшеницы Triticum aestivum L.с проницаемостью клеточных мембран и их фазового состояния при действии мембранотропных веществ.
В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи:
1) определить проницаемость мембран клеток корней проростков, выращенных на средах с добавлением мембранотропных веществ, для электролитов путем оценки их выхода методом кондуктометрии;
2) исследовать липидный профиль в корнях проростков, выращенных на средах с добавлением мембранотропных веществ, методом инструментальной тонкослойной хроматографии на лабораторном комплексе «CAMAG» (Швейцария);
3) оценить величину генерализованной поляризации возбуждения флуоресценции липофильного зонда лаурдана в мембранах микросомальной
фракции клеток корней проростков пшеницы, выращенных на средах с добавлением мембранотропных веществ.
Научная новизна.
Впервые исследован качественный состав липидных соединений и определенно их количество в корнях проростков пшеницы, выращенных при воздействии СаС12(10-3 М) и Д-ситостерин (5*10-4 М), уплотняющих мембрану, а также нистатина (10-4 М) и детергента тритон Х-100 (1,6-10-5 М), которые увеличивают ее проницаемость.
Показано, что при выращивании пшеницы на среде с добавлением Д- ситостерина происходит существенное изменение состава липидов в клетках корней. Происходит увеличением стеринов и моногалактозилдиацилгрицерида (в 3,4 и 2 раза, соответственно) и снижение фосфатидилхолина и гликоцерамидов (1,4 и 2, соответственно) При этом обнаруженные изменения в липидном профиле влияют на мембранные характеристики клеток корней пшеницы - увеличение мембранной стабильности на 4,7 % и уплотнение мембран в 1,3 раза.
Установлено, что при выращивании растений в течение 4 суток на среде с добавлением нистатина в концентрации 10-4 М, происходит адаптация растений к данному мембранотропу, которая заключается в восстановлении мембранных характеристик - текучести и проницаемости. Одним из факторов в этом механизме адаптации является снижение (в 3,3 раза) количества в мембранах доли стеринов.
Практическая значимость.
Методические разработки и данные представленные в диссертации Белкиной А. В. имеют научно-прикладную значимость и могут быть использованы в исследовательских и образовательных учреждений.
По результатам исследования опубликованы 1 статья и 3 тезиса доклада: в материалах: II международного симпозиума «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Уфа, 2017), IV российского симпозиума с международным участием «Фитоиммунитет и клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2016), годичного собрания общества физиологов растений России «Экспериментальная биология растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Судак, 2017).
Часть результатов работы получена в лаборатории Окислительно - восстановительного метаболизма КИББ ФИЦ КазНЦ РАН.
Автор выражает благодарность соавторам за помощь в проведении экспериментов и обсуждении полученных результатов.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ (№ 16 - 04 - 00676 А).
1) Установлено, что при воздействии хлорида кальция в липидном составе клеток корней пшеницы изменений не происходит, при этом увеличивается индекс мембранной стабильности на 7 %, по величине генерализованнной поляризации, полученной спектральным методом с флуоресцентным зондом, мембраны (в 1,2 раза) становятся более упорядоченными;
2) Показано, что при действии Д-ситостерина в клетках корней пшеницы происходит увеличение мембранной стабильности на 4,7 % и упорядоченности липидного бислоя, что очевидно связано с обнаруженными изменениями в их липидном составе содержания следующих соединений - увеличением стеринов и моногалактозилдиацилгрицерида ( в 3,4 и 2 раза соответственно) и снижением фосфатидилхолина и гликоцерамидов (1,4 и 2 соответственно);
3) Выявлено, что в клетках корней пшеницы при выращивании на растворе нистатина в течении 4 суток не происходит снижения мембранной стабильности и упорядоченности мембран, что свидетельствует о более высоком адаптационном ресурсе растений к дестабилизирующему действию примененного мембранотропного соединения, в частности за счет уменьшения в липидном профиле количества стеринов (в 3,3 раза);
4) При обработке корней пшеницы тритоном Х - 100 наблюдается сильное повреждение клеточных мембран - увеличивается выход электролитов в 2 раза, и почти на 28 % снижается индекс мембранной стабильности. Это воздействие вызывает у растений стрессовый ответ. Показано, что происходит увеличение доли терпеноидов в сумме липидов, которые являются предшественниками биосинтеза стеринов, выполняющих в растениях регуляторную и структурную функции.
2) Показано, что при действии Д-ситостерина в клетках корней пшеницы происходит увеличение мембранной стабильности на 4,7 % и упорядоченности липидного бислоя, что очевидно связано с обнаруженными изменениями в их липидном составе содержания следующих соединений - увеличением стеринов и моногалактозилдиацилгрицерида ( в 3,4 и 2 раза соответственно) и снижением фосфатидилхолина и гликоцерамидов (1,4 и 2 соответственно);
3) Выявлено, что в клетках корней пшеницы при выращивании на растворе нистатина в течении 4 суток не происходит снижения мембранной стабильности и упорядоченности мембран, что свидетельствует о более высоком адаптационном ресурсе растений к дестабилизирующему действию примененного мембранотропного соединения, в частности за счет уменьшения в липидном профиле количества стеринов (в 3,3 раза);
4) При обработке корней пшеницы тритоном Х - 100 наблюдается сильное повреждение клеточных мембран - увеличивается выход электролитов в 2 раза, и почти на 28 % снижается индекс мембранной стабильности. Это воздействие вызывает у растений стрессовый ответ. Показано, что происходит увеличение доли терпеноидов в сумме липидов, которые являются предшественниками биосинтеза стеринов, выполняющих в растениях регуляторную и структурную функции.