РЕФЕРАТ 4
ОГЛАВЛЕНИЕ 6
ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ 8
ВВЕДЕНИЕ 9
1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР 11
1.1 Криолитозона - временное хранилище углерода и криобанк
микроорганизмов 11
1.1.1 Генезис и развитие криолитозоны Северного полушария 12
1.1.2 Типы вечной мерзлоты 15
1.1.3 Лед в структуре криолитозоны 18
1.1.4 Криолитозона: феномен мирового масштаба 19
1.1.4.1 Распространение криолитозоны на территории России 21
1.1.5 Торфяные болота как часть криолитозоны 22
1.1.5.1 Бугристые торфяники 24
1.5.1.2 Полигональные торфяники 27
1.1.6 Запасы углерода в массивах криолитозоны 29
1.1.7 Жизнь в вечной мерзлоте 29
1.2 Методы изучения экологии микроорганизмов криолитозоны 32
1.2.1 Метагеномное секвенирование маркерного гена 16S рРНК 33
1.2.2 Гены mcrA и pmoA как альтернатива 16S рРНК в филогенетическом
анализе популяций метаногенов и метанотрофов 33
1.2.3 Мечение ДНК стабильными изотопами как метод выявления активных
форм бактерий 34
1.2.4 Метод фингерпринтов 36
1.2.4.1 Терминальный полиморфизм длин рестрикционных фрагментов 36
1.3 Исследования состава сообществ микроорганизмов криолитозоны 37
1.3.1 Структура микробных сообществ двух торфяно-болотных почв Сибири37
1.3.2 Эффект оттепели на бактериальные сообщества вечной мерзлоты 38
1.4 Выводы по аналитическому обзору 40
2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42
2.1 Объект исследования 42
2.2 Методы исследования 43
2.2.1 Непрямая экстракция ДНК 43
2.2.2 Методы прямой экстракции ДНК 44
2.2.2.1 Выделение ДНК коммерческим набором PureLinkTM Microbiome
DNA Purification Kit 44
2.2.2.2 Экстракция ДНК с использованием TENC буфера 45
2.2.2.3 Гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформная экстракция 46
2.2.2.4 Экстракция ДНК с помощью GTAB буфера 47
2.2.3 Постановка полимеразной цепной реакции 47
2.2.4 Полимеразная цепная реакция в реальном времени 48
2.2.5 Электрофоретическое определение молекулярной массы ДНК 49
2.2.6 Высокопроизводительное секвенирование гена 16S рРНК 49
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 51
3.1 Характеристика объекта исследования 51
3.1.1 Общее количество микроорганизмов 53
3.2 Сравнение методов экстракции ДНК из мерзлого торфа 54
3.3 Таксономическая структура торфяника 58
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 63
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Более 20 % поверхности Земли подстилается вечной мерзлотой, в которой заключено от 25-50 % общего глобального углеродного пула почвы. Снижение микробной активности в условиях криолитозоны в значительной степени защищает этот углерод от микробного разложения, но продолжающееся изменение климата может привести к крупномасштабному таянию вечной мерзлоты, тем самым открывая огромные запасы углерода для деградации. Предполагается, что микробная активность в почвах вечной мерзлоты может стать одним из основных факторов, изменяющих цикл органического углерода и азота, вызывая положительную динамику изменения климата. Эта гипотеза особенно верна для мерзлых торфяников - естественных стоков атмосферного углерода (С), локализованных на территории Западной и Северной Сибири, которые содержат значительные количества Соргкак в верхнем (оттаявшем) торфяном слое, так и в замороженных органических и минеральных горизонтах. Тем не менее, мерзлые торфяные почвы остаются практически не охарактеризованными с точки зрения физиологического разнообразия и метаболического потенциала бактерий [2].
В свою очередь технологии высокопроизводительного секвенирования и другие - омиксные технологии дают возможность изучить механизмы, с помощью которых микробные сообщества регулируют деградацию углерода и выбросы парниковых газов из районов вечной мерзлоты. Анализ нуклеиновых кислот и белков, взятых непосредственно из торфяных почв, позволяет по-новому взглянуть на микробные сообщества и их функции в условиях криолитозоны.
Таким образом, в условиях современного глобального потепления является актуальным изучение бактериального сообщества криолитозоны, поскольку она на протяжении многих тысячелетий накапливала органические вещества, выступая в качестве поглотителя атмосферного углерода, для выявления обратной связи деградации криолитозоны, на глобальный цикл углерода. Особенно это касается торфяников Западной Сибири, которые в течение последних десятилетий, активно деградирует. Однако, несмотря на то, что современные генетические методы позволяют избежать ошибочной оценки таксономического и количественного состава микробоценоза, надежность и достоверность молекулярных исследований зависит от качества выделенной ДНК. В результате чего, в данной работе для изучения таксономического состава микробиома бугристого болота, были использованы прямые и непрямые методы экстракции ДНК, для сравнения их эффективности, а также проведен метагеномный анализ участка гена 16S рРНК.
В вечной мерзлоте накапливается большое количество органического углерода. Однако в условиях современного глобального потепления прогнозируется усиленная деградация криолитозоны и высвобождение значительного количества законсервированного в настоящее время органического вещества для микробного разложения глобального запаса углерода, с последующей эмиссией парниковых газов, способствуя тем самым усилению изменения климата. Что особенно актуально для мерзлых торфяников Западно-Сибирской равнины, поскольку недавние исследования показали, что вечная мерзлота на данной территории, в течение последних десятилетий, активно деградирует. Несмотря на это мерзлые торфяные почвы остаются практически не охарактеризованными с точки зрения таксономической структуры микробоценоза и их метаболического потенциала.
С целью улучшить наше понимание возможных текущих и будущих последствий деградации криолитозоны, а так же оценить возможный потенциал бактериального сообщества криолитозоны, с помощью современных молекулярно-генетических методов была изучена структура бактериального сообщества торфяных горизонтов, отобранный на различной глубине (до 1 м) бугристого (торфяного) болота, расположенного в зоне прерывистой вечной мерзлоты вблизи района Ханымей. По мере углубления, количество микроорганизмов снижается с 1,35*1010до 2,27x107 что связано с ужесточением условий окружающей среды.
В бактериальном сообществе торфяника доминировали следующие филы: Proteobacteria(19-89 %), Acidobacteria(1,8-58,2 %), Actinobacteria(1,7-19,6 %), Firmicute(до 15,8 %), Planctomycetes(до 7,9 %).
Acidobacteriaи Proteobacteriaбыли обнаружены в каждом горизонте почвы. Однако, после надмерзлотного слоя (40-60 см) количество представителей Acidobacteriaснижается. Данный факт, связан с тем, что более высокое содержание питательных веществ является ингибирующим фактором, так как известно, что представители этого типа ведут олиготрофный образ жизни.
