Введение 4
II. Обзор литературы 6
II.1. Влияние антропогенной эвтрофикации на морские экосистемы 6
11.2. Краткая характеристика типа Dinoflagellata 7
11.3. Влияние условий внешней среды на физиологию и морфологию
фитопланктонных организмов 9
11.3.1. Размер и форма клеток 10
11.3.2. Количество пиментов в клетке 11
11.3.3. Скорость поглощения неорганического углерода 12
11.3.4. Скорость поглощения азота 12
11.3.5. Интенсивность синтеза РНК 13
11.4. Prorocentrum minimum:причины успешного распространения 13
III. Методы 17
III.1. Объекты исследования 17
III.2 Периодическое культивирование клонов P. minimum 17
III.3. Проточное культивирование P. minimum 18
III.4. Световая микроскопия и определение плотности культуры 20
III.6. Измерение синтеза РНК по включению 3Н-уридина 20
III.7. Измерение поглощения азота и углерода 20
III.7. Расчет интенсивности поглощения 21
III. 8. Измерение интенсивности флуоресценции 22
III. 9. Измерение длины клеток 22
III. 10. Измерение концентрации азота и углерода 22
III. 14. Молекулярные методы 23
III. 14. 1. Выделение ДНК из клеток P. minimum 23
III. 14. 2. Конструирование праймеров 23
III. 14. 3. Условия полимеразной цепной реакции (ПЦР) 24
III. 14. 4. Электрофоретическое разделение ампликонов 24
III. 14. 5. Выделение амплифицированных фрагментов ДНК из агарозного геля ... 25
III. 14. 6. Секвенирование ДНК 25
III.15. Статистический анализ данных 25
IV. Результаты и обсуждение 26
IV.1. Влияние различных сочетаний источников азота на уровень синтеза РНК и флуоресценцию пигментов в опытах с периодической культурой 26
IV.2. Влияние различных сочетаний источников азота на морфологические и физиологические параметры клеток в опытах с проточной культурой 29
IV.2.1. Динамика роста клеток в проточных культурах 29
IV.2.2. Измерение физиологических параметров клеток в проточных культурах ... 32
IV.2.3. Анализ морфологических характеристик клеток 36
IV.2.4. Измерение скорости поглощения азота и углерода 39
IV.3. Результаты анализа и амплификации генов транспортера мочевины и транспортера нитрата 40
Выводы 46
Список литературы 48
Приложение 58
Усиление глобального антропогенного влияния приводит к изменениям состава морской воды, особенно в эстуарных зонах, куда осуществляется массовый экспорт биогенных веществ. Сельскохозяйственная и животноводческая активность, смыв удобрений, промышленные сбросы способствуют эвтрофикации морских экосистем, что, в свою очередь, приводит к интенсивному развитию фитопланктона и учащению формирования обильных цветений микроводорослей.
Фитопланктонные микроорганизмы являются важнейшими первичными продуцентами в мировом океане и играет важную роль в морских экосистемах и глобальных биогеохимических циклах (Falkowski, 2012). В условиях глобальной эвтрофикации возникает необходимость в изучении влияния изменения состава воды на физиологические параметры водорослей. В связи с изменяющимися условиями некоторые группы микроорганизмов привлекают к себе все больший научный интерес, к одной из них относятся протисты типа Dinoflagellata.
Несмотря на то что в последние несколько десятилетий тип Dinoflagellata активно исследуется в полевых условиях и в лабораториях разных стран мира, информация о некоторых аспектах их жизнедеятельности представлена не в полном объеме. До сих пор не было произведено полное секвенирование генома этих организмов, и многие белки не были выделены и охарактеризованы. Тем не менее, в условиях эвтрофикации изучение азотного метаболизма динофлагеллят представляет интерес, поскольку именно повышенная концентрация азота в морской воде в первую очередь предоставляет им конкурентное преимущество и позволяет образовывать интенсивные цветения, также известные как «красные приливы». Изучение механизмов регуляции азотного метаболизма динофлагеллят позволит расширить понимание экологических процессов и влияния содержания азота в морской воде на динамику популяций фитопланктона.
На данный момент в литературе хорошо освещено влияние концентрации источников азота в среде на физиологические и морфологические параметры динофлагеллят (Ou et al., 2014; Olenina et al., 2016), однако очень малое количество работ посвящено влиянию непосредственно формы азота на клетки. Это немаловажно, поскольку динофлагелляты демонстрируют выраженные предпочтения при поглощении различных источников азота. Предположительно, наличие различных форм азота в среде может по-разному влиять на биосинтетические процессы, проходящие в клетке, и тем самым обусловливать вариабельность морфологических и физиологических параметров.
Целью работы было изучить влияние различных источников азота и их комбинаций на морфологию и физиологию динофлагеллят.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние различных источников азота и их комбинаций на морфологические и физиологические параметры клеток, растущих в периодической культуре;
2. Изучить влияние различных источников азота на морфологические и физиологические параметры клеток, растущих в проточной культуре;
3. Сконструировать праймеры к генам транспортера мочевины и транспортера нитрата и амплифицировать фрагменты этих генов у лабораторных клонов Prorocentrum minimum.
Работа частично поддержана грантами РНФ, проект 16-14-10116, и РФФИ, проект 15-29-02706.
1. Уровень синтеза РНК и скорость ассимиляции азота в периодических и проточных культурах P. minimumзависят от типа и концентрации экзогенного источника азота.
2. Размер клеток P. minimum,автофлуоресценция пигментов и скорость поглощения углерода не зависят от типа источника азота.
3. Амплификация тотальной ДНК P. minimumс использованием специально сконструированных праймеров свидетельствует о наличии генов транспортера нитрата NRT2.1 и транспортера мочевины DUR3.