Регуляция экспрессии епцифических белков печени и транскрипционных факторов в гепатокарциномах мышей
|
Введение
Глава 1. Обзор литературы
Краткий обзор семейств гепатоцитарных ядерных факторов.
Семейство С/ЕВР.
Семейство HNF1 Семейство HNF3 Семейство HNF6 Семейство HNF4 Супер-семейство ядерных рецепторов Развитие печени
Семейство GATA Развитие поджелудочной железы
Обобщение сведений о локализации и влиянии ГЯФ на гепато-специфическую экспрессию.
Обеспечение гепатоцитарного фенотипа - взаимная регуляция ГЯФ.
HNF4 - один из важнейших ГЯФ
Роль ГЯФ при регенерации и вирусной инфекции
Нарушения экспрессии ГЯФ
Гепатоцеллюлярные карциномы
ГЯФ при канцерогенезе
Заключение
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы
Список использованных растворов и сред.
Линии перевиваемых гепатокарцином Клеточные линии.
Бактериальные штаммы и плазмидные векторы.
Трансформация клеток Е. Coli.
Выделение нуклеиновых кислот Электрофорез нуклеиновых кислот
Метод “Обратная Транскрипция - Полимеразная Цепная Реакция” (ОТ-ПЦР) Метод TRAP (Telomerese Repeate Amplification Protocol)
Авторадиография
Иммунохимическое выявление белков Сканирование и компьютерная обработка результатов.
Глава 3. Результаты исследований Описание исследуемой модели гепатокарцином мышей Восстановление экспрессии гена HNF4a в культуре клеток НЗЗ Анализ коллекции перевиваемых гепатокарцином мышей Глава 4. Обсуждение полученных результатов
Экспрессия HNF4a коррелирует с уровнем дифференцировки гепатокарцином. Изменение экспрессии ГЯФ и некоторых транскрипционных факторов при прогрессии ГК мышей.
Снижение уровня дифференцировки при прогрессии ГК мышей.
Утрата эпителиальных свойств при прогрессии ГК мышей
Индукция активности гена с-шус и активация теломеразного комплекса.
Восстановление экспрессии гена HNF4a
Восстановление некоторых эпителиальных свойств.
Восстановление экспрессии гепато-специфических транскрипционных регуляторов.
Выводы
Список литературы
Глава 1. Обзор литературы
Краткий обзор семейств гепатоцитарных ядерных факторов.
Семейство С/ЕВР.
Семейство HNF1 Семейство HNF3 Семейство HNF6 Семейство HNF4 Супер-семейство ядерных рецепторов Развитие печени
Семейство GATA Развитие поджелудочной железы
Обобщение сведений о локализации и влиянии ГЯФ на гепато-специфическую экспрессию.
Обеспечение гепатоцитарного фенотипа - взаимная регуляция ГЯФ.
HNF4 - один из важнейших ГЯФ
Роль ГЯФ при регенерации и вирусной инфекции
Нарушения экспрессии ГЯФ
Гепатоцеллюлярные карциномы
ГЯФ при канцерогенезе
Заключение
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы
Список использованных растворов и сред.
Линии перевиваемых гепатокарцином Клеточные линии.
Бактериальные штаммы и плазмидные векторы.
Трансформация клеток Е. Coli.
Выделение нуклеиновых кислот Электрофорез нуклеиновых кислот
Метод “Обратная Транскрипция - Полимеразная Цепная Реакция” (ОТ-ПЦР) Метод TRAP (Telomerese Repeate Amplification Protocol)
Авторадиография
Иммунохимическое выявление белков Сканирование и компьютерная обработка результатов.
Глава 3. Результаты исследований Описание исследуемой модели гепатокарцином мышей Восстановление экспрессии гена HNF4a в культуре клеток НЗЗ Анализ коллекции перевиваемых гепатокарцином мышей Глава 4. Обсуждение полученных результатов
Экспрессия HNF4a коррелирует с уровнем дифференцировки гепатокарцином. Изменение экспрессии ГЯФ и некоторых транскрипционных факторов при прогрессии ГК мышей.
Снижение уровня дифференцировки при прогрессии ГК мышей.
Утрата эпителиальных свойств при прогрессии ГК мышей
Индукция активности гена с-шус и активация теломеразного комплекса.
Восстановление экспрессии гена HNF4a
Восстановление некоторых эпителиальных свойств.
Восстановление экспрессии гепато-специфических транскрипционных регуляторов.
Выводы
Список литературы
Актуальность исследования.
Злокачественный рост клеток основан на автономной и неограниченной пролиферации клеточного клона, выходящего за пределы собственной ткани и способного к росту в негомологичных тканях. При этом опухоль представляет собой популяцию генетически нестабильных клеток, в которых происходит постоянное накопление мутаций, ведущих к эволюции опухоли в сторону более агрессивного фенотипа. Это явление, получившее название опухолевой прогрессии, является фундаментальным свойством опухолей различного происхождения, но всегда определяется свойствами исходной ткани, давшей начало опухоли.
Гепатокарцинома (ГК) - один из самых часто встречаемых раков в мире, лечение которого осложняется тем, что опухоли обычно образуются на базе хронических заболеваний печени. По эпидемиологическим данным, хронические инфекции вирусами HBV и HCV являются причиной до 80% ГК в мире.
Вирусные инфекции вызывают хронические воспаления печени, при которых в ткани высок уровень клеточной смерти и пролиферации. Это пренеопластическая стадия; при стимуляции, например, оксидативным стрессом или воспалительными цитокинами, происходит злокачественная трансформация клеток (Buendia, 2000).
Прогрессия ГК сопровождается снижением уровня дифференцировки, сопряженным с подавлением экспрессии ткане-специфических генов, увеличением скорости пролиферации клеток, утратой эпителиальной морфологии, приобретением инвазивности и способности к метастазированию. Однако карциномы часто сохраняют способность к ре-дифференцировке.
Возможность реверсии низко-дифференцированных гепатом к более дифференцированным была показана in vitro (Spath and Weiss, 1998) при экзогенной экспрессии гена гепатоцитарного ядерного фактора (HNF) 4а - специфичного для печени регулятора транскрипции.
Определяющую роль в регуляции экспрессии большинства генов, специфичных для печени, и в поддержании дифференцировочного статуса клеток играет соотношение в клетке уровней так называемых гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), к которым относят несколько семейств регуляторных белков: HNF1, С/EBP, HNF3, HNF4 и HNF6. Тканевая специфичность экспрессии печень-специфических генов достигается, по- видимому, одновременным участием нескольких гепатоцитарных факторов в регуляции их транскрипции. Между экспрессией ГЯФ существуют тесные связи, однако,
6
иерархические отношения между представителями различных семейств факторов пока исследованы недостаточно полно.
В настоящей работе роль ГЯФ в профессии ГК исследована на созданной в НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН коллекции перевиваемых ГК мыши, полученных из химически индуцированных первичных опухолей. В эту коллекцию входят также две ГК единого происхождения, резко различающиеся по скорости роста и уровню дифференцировки: медленно-растущая дифференцированная ГК мыши (мГК) и одномоментно выщепившийся из нее на раннем пассаже, по-видимому, в результате инактивации одного или немногих ключевых генов, быстро-растущий де- дифференцированный вариант (6ГК).
Мы предположили, что сравнение свойств мГК и 6ГК позволит идентифицировать генетические пути, определяющие основные свойства прогрессии ГК, и приступить к разработке новых подходов к нормализации злокачественного фенотипа, а также к диагностике ГК.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы была идентификация генов и выявление молекулярных механизмов, которые лежат в основе прогрессии и де-дифференцировки опухолей печени.
В рамках этой проблемы основное внимание было сосредоточено на определении роли гепатоцитарных транскрипционных факторов и неткане-специфических регуляторов, экспрессия которых изменяется в ходе прогрессии опухолей, и поиске путей реверсии злокачественного фенотипа.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:
• Провести сравнительную характеристику медленной и быстрой ГК мышей с целью идентификации генов, в экспрессии которых при скачкообразной прогрессии от мГК к 6ГК произошли существенные изменения.
• Охарактеризовать гены, экспрессия которых прямо или обратно коррелирует с уровнем дифференцировки при прогрессии.
• Проанализировать роль HNF4a в поддержании уровня дифференцировки, установлении эпителиального фенотипа и регуляции экспрессии гепато- специфических генов в ГК мышей in vitro.
7
Научная новизна и практическая ценность работы
Новизна исследования в первую очередь связана с использованием имеющихся в нашем распоряжении уникальных моделей: коллекции химически идуцированных ГК с различной скоростью роста и уровнем дифференцировки и системы ГК мышей единого происхождения (мГК и 6ГК), резко отличающихся по скорости роста, дифференцировочному статусу и морфологическим характеристикам, а также к>лыры клеток 6ГК (НЗЗ).
Это позволило методом полуколичественного ОТ-ПЦР впервые провести полный анализ спектров экспрессии ГЯФ, определяющих фенотип печени, при прогрессии ГК.
Наши результаты показали, что уровень транскрипции HNF4a, одного из ключевых гепато-специфических регуляторов, коррелирует с уровнем экспрессии маркеров дифференцировки и общим дифференцировочным статусом химически индуцированных ГК, о котором мы можем судить по морфологическим признакам. Ранее подобные исследования опухолей печени in vivo не проводились.
В работе впервые показано, что по сравнению с нормальной печенью, в ГК, сохраняющих высокий уровень дифференцировки, параллельно с ре-экспрессией онко- эмбрионального маркера a-фетопротеина (АФП) происходит активация транскрипции эмбриональной изоформы HNF4a7.
Нами показано, что при прогрессии произошли резкие изменения в экспрессии целого блока ГЯФ и других транскрипционных регуляторов. Значительно снижена экспрессия HNF1, vHNFl, C/EBPa, HNF4a, HNF3y и HNF6, ядерного рецептора FTF и энтодермального фактора GATA4 и активируется транскрипция ядерного рецептора COUP-TFI. Изменений в экспрессии ряда других транскрипционных факторов: С/ЕВРр, HNF3a, HNF3J3, ядерного рецептора COUP-TFII, энтодермального фактора GATA 6 не произошло. Основные закономерности экспрессии ГЯФ, выявленные на этой модели, подтверждены на коллекции химически индуцированных ГК с различным уровнем дифференцировки.
Нами показано, что наряду со снижением уровня дифференцировки прогрессия от мГК к 6ГК сопровождается активацией онкогена с-тус и теломеразного комплекса.
При прогрессии ГК активируется экспрессия транскрипционного регулятора Snail - индуктора эпителиально-мезенхимального перехода.
При экзогенной экспрессии HNF4a в культуре клеток НЗЗ мы наблюдали частичное восстановление экспрессии гепато-специфических генов.
Впервые получены свидетельства того, что фактор HNF4a прямо или косвенно способен активировать экспрессию генов ГЯФ HNF6 и HNF4a7 и транскрипцию ядерного
рецептора FTF. Таким образом, под воздействием экзогенной экспрессии HNF4a в культуре НЗЗ произошел сдвиг в сторону приобретения более дифференцированного гепато-специфического фенотипа.
Изучение возможностей реверсии опухолевого фенотипа и идентификация генов.
tl
участвующих в этом процессе, а также определение механизмов регуляции генов опухолевых маркеров относится к фундаментальным исследованиям природы опухолевого роста и имеет прямое отношение к разработке методов диагностики и биотерапии злокачественных опухолей. Повышение уровня дифференцировки в ГК может увеличить чувствительность опухоли к терапии.
Злокачественный рост клеток основан на автономной и неограниченной пролиферации клеточного клона, выходящего за пределы собственной ткани и способного к росту в негомологичных тканях. При этом опухоль представляет собой популяцию генетически нестабильных клеток, в которых происходит постоянное накопление мутаций, ведущих к эволюции опухоли в сторону более агрессивного фенотипа. Это явление, получившее название опухолевой прогрессии, является фундаментальным свойством опухолей различного происхождения, но всегда определяется свойствами исходной ткани, давшей начало опухоли.
Гепатокарцинома (ГК) - один из самых часто встречаемых раков в мире, лечение которого осложняется тем, что опухоли обычно образуются на базе хронических заболеваний печени. По эпидемиологическим данным, хронические инфекции вирусами HBV и HCV являются причиной до 80% ГК в мире.
Вирусные инфекции вызывают хронические воспаления печени, при которых в ткани высок уровень клеточной смерти и пролиферации. Это пренеопластическая стадия; при стимуляции, например, оксидативным стрессом или воспалительными цитокинами, происходит злокачественная трансформация клеток (Buendia, 2000).
Прогрессия ГК сопровождается снижением уровня дифференцировки, сопряженным с подавлением экспрессии ткане-специфических генов, увеличением скорости пролиферации клеток, утратой эпителиальной морфологии, приобретением инвазивности и способности к метастазированию. Однако карциномы часто сохраняют способность к ре-дифференцировке.
Возможность реверсии низко-дифференцированных гепатом к более дифференцированным была показана in vitro (Spath and Weiss, 1998) при экзогенной экспрессии гена гепатоцитарного ядерного фактора (HNF) 4а - специфичного для печени регулятора транскрипции.
Определяющую роль в регуляции экспрессии большинства генов, специфичных для печени, и в поддержании дифференцировочного статуса клеток играет соотношение в клетке уровней так называемых гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), к которым относят несколько семейств регуляторных белков: HNF1, С/EBP, HNF3, HNF4 и HNF6. Тканевая специфичность экспрессии печень-специфических генов достигается, по- видимому, одновременным участием нескольких гепатоцитарных факторов в регуляции их транскрипции. Между экспрессией ГЯФ существуют тесные связи, однако,
6
иерархические отношения между представителями различных семейств факторов пока исследованы недостаточно полно.
В настоящей работе роль ГЯФ в профессии ГК исследована на созданной в НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН коллекции перевиваемых ГК мыши, полученных из химически индуцированных первичных опухолей. В эту коллекцию входят также две ГК единого происхождения, резко различающиеся по скорости роста и уровню дифференцировки: медленно-растущая дифференцированная ГК мыши (мГК) и одномоментно выщепившийся из нее на раннем пассаже, по-видимому, в результате инактивации одного или немногих ключевых генов, быстро-растущий де- дифференцированный вариант (6ГК).
Мы предположили, что сравнение свойств мГК и 6ГК позволит идентифицировать генетические пути, определяющие основные свойства прогрессии ГК, и приступить к разработке новых подходов к нормализации злокачественного фенотипа, а также к диагностике ГК.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы была идентификация генов и выявление молекулярных механизмов, которые лежат в основе прогрессии и де-дифференцировки опухолей печени.
В рамках этой проблемы основное внимание было сосредоточено на определении роли гепатоцитарных транскрипционных факторов и неткане-специфических регуляторов, экспрессия которых изменяется в ходе прогрессии опухолей, и поиске путей реверсии злокачественного фенотипа.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:
• Провести сравнительную характеристику медленной и быстрой ГК мышей с целью идентификации генов, в экспрессии которых при скачкообразной прогрессии от мГК к 6ГК произошли существенные изменения.
• Охарактеризовать гены, экспрессия которых прямо или обратно коррелирует с уровнем дифференцировки при прогрессии.
• Проанализировать роль HNF4a в поддержании уровня дифференцировки, установлении эпителиального фенотипа и регуляции экспрессии гепато- специфических генов в ГК мышей in vitro.
7
Научная новизна и практическая ценность работы
Новизна исследования в первую очередь связана с использованием имеющихся в нашем распоряжении уникальных моделей: коллекции химически идуцированных ГК с различной скоростью роста и уровнем дифференцировки и системы ГК мышей единого происхождения (мГК и 6ГК), резко отличающихся по скорости роста, дифференцировочному статусу и морфологическим характеристикам, а также к>лыры клеток 6ГК (НЗЗ).
Это позволило методом полуколичественного ОТ-ПЦР впервые провести полный анализ спектров экспрессии ГЯФ, определяющих фенотип печени, при прогрессии ГК.
Наши результаты показали, что уровень транскрипции HNF4a, одного из ключевых гепато-специфических регуляторов, коррелирует с уровнем экспрессии маркеров дифференцировки и общим дифференцировочным статусом химически индуцированных ГК, о котором мы можем судить по морфологическим признакам. Ранее подобные исследования опухолей печени in vivo не проводились.
В работе впервые показано, что по сравнению с нормальной печенью, в ГК, сохраняющих высокий уровень дифференцировки, параллельно с ре-экспрессией онко- эмбрионального маркера a-фетопротеина (АФП) происходит активация транскрипции эмбриональной изоформы HNF4a7.
Нами показано, что при прогрессии произошли резкие изменения в экспрессии целого блока ГЯФ и других транскрипционных регуляторов. Значительно снижена экспрессия HNF1, vHNFl, C/EBPa, HNF4a, HNF3y и HNF6, ядерного рецептора FTF и энтодермального фактора GATA4 и активируется транскрипция ядерного рецептора COUP-TFI. Изменений в экспрессии ряда других транскрипционных факторов: С/ЕВРр, HNF3a, HNF3J3, ядерного рецептора COUP-TFII, энтодермального фактора GATA 6 не произошло. Основные закономерности экспрессии ГЯФ, выявленные на этой модели, подтверждены на коллекции химически индуцированных ГК с различным уровнем дифференцировки.
Нами показано, что наряду со снижением уровня дифференцировки прогрессия от мГК к 6ГК сопровождается активацией онкогена с-тус и теломеразного комплекса.
При прогрессии ГК активируется экспрессия транскрипционного регулятора Snail - индуктора эпителиально-мезенхимального перехода.
При экзогенной экспрессии HNF4a в культуре клеток НЗЗ мы наблюдали частичное восстановление экспрессии гепато-специфических генов.
Впервые получены свидетельства того, что фактор HNF4a прямо или косвенно способен активировать экспрессию генов ГЯФ HNF6 и HNF4a7 и транскрипцию ядерного
рецептора FTF. Таким образом, под воздействием экзогенной экспрессии HNF4a в культуре НЗЗ произошел сдвиг в сторону приобретения более дифференцированного гепато-специфического фенотипа.
Изучение возможностей реверсии опухолевого фенотипа и идентификация генов.
tl
участвующих в этом процессе, а также определение механизмов регуляции генов опухолевых маркеров относится к фундаментальным исследованиям природы опухолевого роста и имеет прямое отношение к разработке методов диагностики и биотерапии злокачественных опухолей. Повышение уровня дифференцировки в ГК может увеличить чувствительность опухоли к терапии.
1. Впервые показано, что экспрессия HNF4a четко коррелирует с уровнем дифференцировки химически индуцированных гепатокарцином мышей.
2. Впервые описана активация эмбриональных изоформ HNF4a в ГК, сохранивших ткане-специфические свойства. При прогрессии ГК и утрате гепато-специфической экспрессии транскрипция этих изоформ подавляется.
3. Исследованы свойства скачкообразной прогрессии от медленнорастущей высокодифференцированной гепатомы (мГК) к быстрорастущему дедифференцированному варианту (6ГК).
При прогрессии происходит:
• подавление экспрессии генов маркеров дифференцировки СА, ТТР, ТФН и онко- эмбрионального маркера АФП,
• подавление экспрессии ГЯФ: HNF1, C/EBPa, HNF3y HNF4a и HNF6, ранних энтодермальных факторов GATA4 .• и ядерного рецептора FTF;
• индукция экспрессии ткане-специфического регулятора COUP-TFI;
• активация транскрипционного регулятора Snail,
• активация теломеразного комплекса;
• индукция экспрессии генов c-myc и его гена-мишени ODC;
• утрата эпителиальной морфологии, коррелирующая с подавлением экспрессии гена Е-кадхерина.
4. Выявленные закономерности подтверждены при исследовании коллекции мышиных гепатокарцином.
5. Экзогенная экспрессия HNF4a в культуре НЗЗ быстрорастущей дедифференцированной гепатомы восстанавливает:
• некоторые эпителиальные свойства;
• экспрессию некоторых гепато-специфических генов: HNF6, HNF3y, HNF4a7, ядерного рецептора FTF и подавляет транскрипцию гена COUP-TFI.
116
2. Впервые описана активация эмбриональных изоформ HNF4a в ГК, сохранивших ткане-специфические свойства. При прогрессии ГК и утрате гепато-специфической экспрессии транскрипция этих изоформ подавляется.
3. Исследованы свойства скачкообразной прогрессии от медленнорастущей высокодифференцированной гепатомы (мГК) к быстрорастущему дедифференцированному варианту (6ГК).
При прогрессии происходит:
• подавление экспрессии генов маркеров дифференцировки СА, ТТР, ТФН и онко- эмбрионального маркера АФП,
• подавление экспрессии ГЯФ: HNF1, C/EBPa, HNF3y HNF4a и HNF6, ранних энтодермальных факторов GATA4 .• и ядерного рецептора FTF;
• индукция экспрессии ткане-специфического регулятора COUP-TFI;
• активация транскрипционного регулятора Snail,
• активация теломеразного комплекса;
• индукция экспрессии генов c-myc и его гена-мишени ODC;
• утрата эпителиальной морфологии, коррелирующая с подавлением экспрессии гена Е-кадхерина.
4. Выявленные закономерности подтверждены при исследовании коллекции мышиных гепатокарцином.
5. Экзогенная экспрессия HNF4a в культуре НЗЗ быстрорастущей дедифференцированной гепатомы восстанавливает:
• некоторые эпителиальные свойства;
• экспрессию некоторых гепато-специфических генов: HNF6, HNF3y, HNF4a7, ядерного рецептора FTF и подавляет транскрипцию гена COUP-TFI.
116