Помощь студентам в учебе
Старение стволовых клеток человека в контексте mTOR-сигналинга
|
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Основные понятия о стволовых клетках 9
1.1. История открытия стволовых клеток 9
1.2. Свойства и классификация стволовых клеток 9
1.3. Мезенхимные стволовые клетки 10
1.4. Мезенхимные стволовые клетки человека, выделенные из десквамированного эндометрия
2. Клеточное старение 13
2.1. История развития представлений о феномене старения клеток 13
2.2. Типы клеточного старения и его признаки 14
2.3. Клеточное старение МСК 15
2.4. Механизмы, лежащие в основе стресс-индуцированного клеточного старения
3. Белок mTOR и его регуляция 17
3.1. История открытия mTOR 17
3.2. Доменная структура белка mTOR 18
3.3. Комплексы киназы mTOR 19
3.4. Регуляция mTOR сигналинга 21
4. Функциональная роль mTOR в клетке 24
4.1. Контроль над синтезом белка в клетке комплексом mTORd 25
4.2. Регуляция аутофагии комплексом mTORC1 26
4.3. Роль mTOR в старении 27
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 30
1. Клеточная линия и особенности культивирования клеток 30
2. Моделирование окислительного стресса и условия обработки клеток 30
3. Оценка жизнеспособности клеток методом МТТ 30
4. Электрофорез и иммуноблотинг 31
4.1. Приготовление проб для электрофоретического разделения 31
4.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 31
4.3. Иммуноблотинг со специфическими антителами 31
5. Метод проточной цитофлуориметрии 32
5.1. Анализ изменения размера и количества клеток 32
5.2. Измерение уровня внутриклеточных АФК 33
6. Выявление активности SA-P-Gal 33
7. Использованные реактивы и ингибиторы 33
8. Статистическая обработка данных 33
РЕЗУЛЬТАТЫ 34
1. Выявление роли mTORCl в Н2О2-индуцированном старении эМСК 34
1.1. Выявление эффектов рапамицина на жизнеспособность клеток и на активность компонентов mTORC1 сигнального пути в Н2О2-обработанных эМСК 34
1.2. Оценка влияния ингибирования mTORC1 на пролиферативный статус стареющих эМСК и активность р53/р21^Ь сигнального пути 35
1.3. Исследование эффектов рапамицина на фенотип старения клеток и уровень
внутриклеточных АФК в Н2О2-обработанных эМСК 36
2. Влияние mTOR на Raf/MEK/ERK/p90RSK сигнальный путь в стареющих эМСК 38
3. Влияние AKT киназы на mTORd сигнальный путь и ее роль в преждевременном старении эМСК 39
3.1. Установление роли AKT киназы в регуляции mTORC1 пути при преждевременном старении эМСК 40
3.2. Исследование характера изменения основных признаков старения Н2О2-обработанных эМСК в условиях ингибирования AKT 40
3.3. Анализ пролиферативного статуса клеток и активности р53/р21/ПЬ сигнального пути в Н2О2-обработанных эМСК при действии LY 41
4. Роль белка ERK1/2 в регуляции mTORC1 сигнального пути при стресс-индуцированном старении эМСК 42
4.1. Выявление эффектов U0126 на активность mTORd сигнального пути в Н2О2-
обработанных клетках 42
4.2. Оценка маркеров преждевременного старения клеток в условиях ингибирования активности ERR1/2 43
5. Изучение роли AMPK в регуляции mTORC1 пути в процессе Н2О2-индуцированного старения эМСК 45
ОБСУЖДЕНИЕ 48
ВЫВОДЫ 56
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 57
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Основные понятия о стволовых клетках 9
1.1. История открытия стволовых клеток 9
1.2. Свойства и классификация стволовых клеток 9
1.3. Мезенхимные стволовые клетки 10
1.4. Мезенхимные стволовые клетки человека, выделенные из десквамированного эндометрия
2. Клеточное старение 13
2.1. История развития представлений о феномене старения клеток 13
2.2. Типы клеточного старения и его признаки 14
2.3. Клеточное старение МСК 15
2.4. Механизмы, лежащие в основе стресс-индуцированного клеточного старения
3. Белок mTOR и его регуляция 17
3.1. История открытия mTOR 17
3.2. Доменная структура белка mTOR 18
3.3. Комплексы киназы mTOR 19
3.4. Регуляция mTOR сигналинга 21
4. Функциональная роль mTOR в клетке 24
4.1. Контроль над синтезом белка в клетке комплексом mTORd 25
4.2. Регуляция аутофагии комплексом mTORC1 26
4.3. Роль mTOR в старении 27
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 30
1. Клеточная линия и особенности культивирования клеток 30
2. Моделирование окислительного стресса и условия обработки клеток 30
3. Оценка жизнеспособности клеток методом МТТ 30
4. Электрофорез и иммуноблотинг 31
4.1. Приготовление проб для электрофоретического разделения 31
4.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 31
4.3. Иммуноблотинг со специфическими антителами 31
5. Метод проточной цитофлуориметрии 32
5.1. Анализ изменения размера и количества клеток 32
5.2. Измерение уровня внутриклеточных АФК 33
6. Выявление активности SA-P-Gal 33
7. Использованные реактивы и ингибиторы 33
8. Статистическая обработка данных 33
РЕЗУЛЬТАТЫ 34
1. Выявление роли mTORCl в Н2О2-индуцированном старении эМСК 34
1.1. Выявление эффектов рапамицина на жизнеспособность клеток и на активность компонентов mTORC1 сигнального пути в Н2О2-обработанных эМСК 34
1.2. Оценка влияния ингибирования mTORC1 на пролиферативный статус стареющих эМСК и активность р53/р21^Ь сигнального пути 35
1.3. Исследование эффектов рапамицина на фенотип старения клеток и уровень
внутриклеточных АФК в Н2О2-обработанных эМСК 36
2. Влияние mTOR на Raf/MEK/ERK/p90RSK сигнальный путь в стареющих эМСК 38
3. Влияние AKT киназы на mTORd сигнальный путь и ее роль в преждевременном старении эМСК 39
3.1. Установление роли AKT киназы в регуляции mTORC1 пути при преждевременном старении эМСК 40
3.2. Исследование характера изменения основных признаков старения Н2О2-обработанных эМСК в условиях ингибирования AKT 40
3.3. Анализ пролиферативного статуса клеток и активности р53/р21/ПЬ сигнального пути в Н2О2-обработанных эМСК при действии LY 41
4. Роль белка ERK1/2 в регуляции mTORC1 сигнального пути при стресс-индуцированном старении эМСК 42
4.1. Выявление эффектов U0126 на активность mTORd сигнального пути в Н2О2-
обработанных клетках 42
4.2. Оценка маркеров преждевременного старения клеток в условиях ингибирования активности ERR1/2 43
5. Изучение роли AMPK в регуляции mTORC1 пути в процессе Н2О2-индуцированного старения эМСК 45
ОБСУЖДЕНИЕ 48
ВЫВОДЫ 56
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 57
БЛАГОДАРНОСТИ
Эндометриальные мезенхимные стволовые клетки (эМСК) впервые были обнаружены в десквамированном эндометрии, содержащемся в менструальной крови, в 2007 году (Meng et al., 2007). Показано, что эМСК обладают рядом существенных преимуществ по сравнению с мезенхимными стволовыми клетками (МСК), полученными из других источников, важнейшими из которых являются сохранение стабильного кариотипа и высокой пролиферативной активности при длительном культивировании, способность дифференцироваться в 9 типов клеток трех зародышевых листков, а также не инвазивный и не травматичный для пациента способ их изоляции. Эти особенности делают эМСК привлекательным объектом для использования в заместительной клеточной терапии, и в настоящее время уже есть сообщения о положительных результатах трансплантации эМСК людям, страдающим такими заболеваниями, как рассеянный склероз, мышечная дистрофия Дюшена и сердечная недостаточность (Zhong et al., 2009; Ichim et al., 2010; Bockeria et al., 2013; Ulrich et al., 2013). Известно, что развитие многих заболеваний, для которых описано успешное применение эМСК, сопровождается локальным окислительным стрессом (Agarwal et al., 2005; Di Filippo et al., 2006; Tsutsui et al., 2011; Terrill et al., 2013), следовательно, после трансплантации эМСК могут оказаться в неблагоприятном микроокружении. В связи с этим изучение ответов эМСК на окислительный стресс может моделировать реальные ситуации, возникающие в процессе трансплантации этих клеток при лечении различных заболеваний. Наряду с такими широко распространенными реакциями МСК на стрессовые воздействия, как временная остановка клеточного цикла, репарация повреждений и апоптоз, в последнее время активно исследуется феномен преждевременного старения клеток (Wang, Jang, 2009; Brandl et al., 2011b; Kim et al., 2011; Alekseenko et al., 2012; Cmielova et al., 2012; Ko et al., 2012; Larsen et al., 2012; Burova et al., 2013). Существенным является то, что стареющие МСК, оставаясь метаболически активными, находятся в состоянии необратимого ареста клеточного цикла и, соответственно, утрачивают способность регенерировать поврежденные ткани. Эти факты подчеркивают необходимость исследования механизмов, лежащих в основе преждевременного старения стволовых клеток. Основной пул данных о преждевременном старении МСК в условиях окислительного стресса получен на МСК, выделенных из костного мозга и пуповинной крови. Важно подчеркнуть, что до недавнего времени в литературе полностью отсутствовали сведения о стресс-индуцированном старении эМСК. Однако в 2013 году сотрудниками нашего отдела было убедительно продемонстрировано, что в условиях сублетального окислительного стресса эМСК подвергаются преждевременному старению, которое сопровождается соответствующими фенотипическими изменениями клеток и необратимой потерей пролиферации (Burova et al., 2013). При исследовании механизма, лежащего в основе стресс-индуцированного старения эМСК, мы обнаружили, что в Н2О2-обработанных клетках активируются рбЭ^ПКЬ и p38 MAPK сигнальные каскады (Borodkina et al., 2014). На основании литературных данных мы предположили, что mTORd путь также может быть вовлечен в развитие преждевременного старения эМСК. Таким образом, в настоящей работе представлялось важным изучить роль mTORd и его основных регуляторов в процессе Н2О2-индуцированного старения эМСК.
Цель: исследование роли mTORd сигнального пути в регуляции Н2О2-индуцированного старения эндометриальных стволовых клеток человека.
Задачи:
1. Выявление эффектов рапамицина на активность компонентов mTORd сигнального пути в Н2О2-обработанных эМСК
2. Оценка влияния ингибирования mTORd на пролиферативный статус, активность р53/р21/Rb сигнального пути и фенотип стареющих эМСК
3. Анализ влияния mTORd на Raf/MEK/ERK/p90RSK сигнальный каскад в Н2О2- обработанных эМСК
4. Установление роли AKT киназы в регуляции mTORd пути при преждевременном старении эМСК
5. Исследование характера изменения основных признаков старения Н2О2- обработанных эМСК и активности р53/р21/Rb сигнального пути в условиях ингибирования AKT
6. Выявление роли ERK1/2 в регуляции mTORd пути при стресс-индуцированном старении эМСК
7. Оценка маркеров преждевременного старения эМСК в условиях ингибирования активности ERK1/2
8. Изучение роли AMPK в регуляции mTORd пути в процессе Н2О2- индуцированного старения эМСК
Цель: исследование роли mTORd сигнального пути в регуляции Н2О2-индуцированного старения эндометриальных стволовых клеток человека.
Задачи:
1. Выявление эффектов рапамицина на активность компонентов mTORd сигнального пути в Н2О2-обработанных эМСК
2. Оценка влияния ингибирования mTORd на пролиферативный статус, активность р53/р21/Rb сигнального пути и фенотип стареющих эМСК
3. Анализ влияния mTORd на Raf/MEK/ERK/p90RSK сигнальный каскад в Н2О2- обработанных эМСК
4. Установление роли AKT киназы в регуляции mTORd пути при преждевременном старении эМСК
5. Исследование характера изменения основных признаков старения Н2О2- обработанных эМСК и активности р53/р21/Rb сигнального пути в условиях ингибирования AKT
6. Выявление роли ERK1/2 в регуляции mTORd пути при стресс-индуцированном старении эМСК
7. Оценка маркеров преждевременного старения эМСК в условиях ингибирования активности ERK1/2
8. Изучение роли AMPK в регуляции mTORd пути в процессе Н2О2- индуцированного старения эМСК
1. Рапамицин в концентрации 200 нМ эффективно подавляет фосфорилирование основных мишеней mTORCl, S6K, S6 и 4E-BP1, в Необработанных эМСК.
2. Ингибирование mTORC1 не способствует восстановлению пролиферативного потенциала стареющих клеток; не влияет на активность p53/p21/Rb сигнального пути; предотвращает увеличение размера клеток и приводит к снижению уровня АФК и активности SA-P-Gal в стареющих эМСК.
3. Подавление активности mTORCl способствует усилению активации каждого компонента Raf/MEK/ERK/p90RSK сигнального каскада в Н2О2-обработанных эМСК.
4. Ингибирование AKT приводит к снижению активности mTORCl пути при преждевременном старении эМСК.
5. Подавление активности AKT киназы способствует предотвращению увеличения размера Н2О2-обработанных клеток и снижению активности SA-P-Gal, но не приводит к возобновлению пролиферации стареющих клеток и модуляции функционирования p53/p21/Rb пути.
6. Ингибирование ERK1/2 почти не оказывает влияние на активность mTORC1 пути в стареющих эМСК.
7. Подавление активности ERK1/2 способствует снижению уровня АФК и активности SA-P-Gal в Н2О2-обработанных эМСК, но при этом не приводит к восстановлению пролиферативного потенциала и предотвращению увеличения размера стареющих клеток.
8. AMPK оказывает слабое влияние на mTORC1 и не играет ключевой роли в процессе Н2О2-индуцированного старения эМСК.
2. Ингибирование mTORC1 не способствует восстановлению пролиферативного потенциала стареющих клеток; не влияет на активность p53/p21/Rb сигнального пути; предотвращает увеличение размера клеток и приводит к снижению уровня АФК и активности SA-P-Gal в стареющих эМСК.
3. Подавление активности mTORCl способствует усилению активации каждого компонента Raf/MEK/ERK/p90RSK сигнального каскада в Н2О2-обработанных эМСК.
4. Ингибирование AKT приводит к снижению активности mTORCl пути при преждевременном старении эМСК.
5. Подавление активности AKT киназы способствует предотвращению увеличения размера Н2О2-обработанных клеток и снижению активности SA-P-Gal, но не приводит к возобновлению пролиферации стареющих клеток и модуляции функционирования p53/p21/Rb пути.
6. Ингибирование ERK1/2 почти не оказывает влияние на активность mTORC1 пути в стареющих эМСК.
7. Подавление активности ERK1/2 способствует снижению уровня АФК и активности SA-P-Gal в Н2О2-обработанных эМСК, но при этом не приводит к восстановлению пролиферативного потенциала и предотвращению увеличения размера стареющих клеток.
8. AMPK оказывает слабое влияние на mTORC1 и не играет ключевой роли в процессе Н2О2-индуцированного старения эМСК.