Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
ℹ️Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ТЕХНОЛОГИЯ CRISPR/Cas И ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ СОРТОВ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ АНТОЦИАНОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ) 9
1.1. Методы направленного редактированиям генома 9
1.2. Технология CRISPR/Cas 14
1.3. Транскрипционный фактор MYB биосинтеза антоцианов 17
1.4. Ген ANT1 18
1.5. Общая характеристика антоцианов 19
1.6. Антиоксидативные свойства антоцианов 23
1.7. Бинарная векторная CRISPR-плазмида pTC223 24
1.8. Методы доставки векторных конструкций 24
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 29
2.1. Материалы исследования 29
2.1.1. Трансформируемые растения 29
2.1.2. Приготовление питательных и селективных сред для культивирования
и регенерации трансгенных растений 29
2.1.3. Agrobacterium tumefaciens и A.rhizogenes 32
2.1.4. Плазмида pTC223 32
2.2. Методы исследования 33
2.2.1. Бактериологические методы 33
2.2.2. Генно-инженерные методы 37
2.2.3. Молекулярно-генетические методы 41
2.2.4. Методы изучения антоцианов 46
2.2.5. Биоинформатические методы 49
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 50
3.1. Схема эксперимента 50
3.2. Биоинформатический анализ 50
3.3. Агробактериальная трансформация in vitro 52
3.4. Получение регенерантов 54
3.5. ПЦР-анализ линий бородатых корней 57
3.6. Изменение окраски спиртовых экстрактов антоцианов 58
3.7. Спектрофотометрическое pH-дифференциальное исследование 62
3.8. Агробактериальная трансформация томата in planta 64
3.9. Агробактериальная трансформация рапса (Brassica napus) с
использованием pTC223 65
3.10. Планирование эксперимента по модификация pTC223 для
трансформации растений из семейства Brassicaceae 67
ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ «БИОЛОГИЯ» 70
4.1. Роль и значение биологии в системе школьного образования 70
4.2. Анализ программ и учебников по реализации материалов ВКР в
школьном курсе «Биология» основного общего образования 72
4.3. Разработка урока по биологии в 5 классе на тему «Разнообразие,
распространение, значение растений» 81
4.4. Использование логико-смыслового моделирования в образовательном
процессе 87
ВЫВОДЫ 91
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 93
ПРИЛОЖЕНИЕ 108
📖 Введение
В последнее время наблюдается все ускоряющийся рост населения планеты. Вместе с тем, растет и потребность в продуктах питания, имеющих наилучшую биодоступность и высокое содержание нутриентов. Для этого требуется быстрое создание сортов растений, адаптированных к изменяющимся условиям среды и с резистентностью к новым фитопатогенам (Хлесткина и др., 2016). Существует несколько способов получения растений с ценными для человека признаками.
Вот уже множество столетий человечество проводит селекцию растений на продуктивность и стрессоустойчивость, а также совершенствует технологии возделывания для достижения максимальной плодовитости хозяйственно ценных культур. Совершенствуются и методы селекции. Огромные временные затраты - главный недостаток традиционных методов селекции (массовый и индивидуальный отбор, комбинационная селекция) - в среднем, для выведения нового сорта растения требуется от 7 до 12 лет (Сухарева и др., 2018). Ускорение темпов создания сортов позволяет также сократить посевные селекционные площади и снизить финансовые затраты (Хлесткина и др., 2016). Маркер-опосредованная селекция (Marker-Assisted Selection, MAS) (Азарин и др., 2012) и геномная селекция (Genomic Selection, GS) (Хлесткина, 2013), в основе которых лежит исследование ДНК- маркеров, рассматриваются как наиболее перспективные направления селекции, помогающие не только сократить временные затраты, но и повысить эффективность селекционной работы (Сухарева и др., 2018).
Актуальность проблемы. Помимо селекции существуют более современные и эффективные способы создания новых хозяйственно ценных сортов растений, например, с помощью методов генетической инженерии и геномного редактирования. Эти методы позволяют получить новые генотипы в рамках естественного генетического разнообразия вида (замена аллелей в
При создании трансгенных растений, из-за невозможности проведения сайт-направленного встраивания, зачастую имеет место низкая экспрессия встроенного гена (за счет эффекта положения) или полное отсутствие продукта этого гена (сайленсинг) (Хлесткина и др., 2016). К тому же, встраивание чужеродных последовательностей ДНК в структурную или регуляторную область функционально важных генов, может привести к нарушению метаболизма у растения-реципиента (Gelvin, 1998).
В последние десятилетия были разработаны подходы позволяющие проводить направленное изменение и встраивание генов путем внесения сайт-специфических двуцепочечных разрывов ДНК (Хлесткина и др., 2016). В качестве направляющего агента могут выступать как белковые молекулы (мегануклеазы, ZFN, TALEN), так и нуклеиновые кислоты (химерные ДНК- РНК олигонуклеотиды, CRISPR/Cas) (табл. 1).
Целесообразно использовать для выведения новых сортов растений новейшие технологии, такие как CRISPR/Cas, в первую очередь потому, что эта технология позволяет производить сайт-направленное высокоточное редактирование одновременно несколько генов.
Научная новизна исследования. Несмотря на стремительное распространение технологии CRISPR/Cas, её возможности чаще всего используются для целенаправленного удаления участков ДНК, тогда как в представленном исследовании будет осуществлено встраивание донорной ДНК в определенное место растительного генома (нокин).
Цель исследования: разработка методики создания генетически трансформированных растений (прежде всего Brassicaceae) на основе векторной CRISPR-конструкции pTC223 и её дальнейшая модификация для создания сортов, с повышенным содержанием антоциановых пигментов.
Задачи исследования:
1. Проверка CRISPR-плазмиды pTC223 для агробактериальной трансформации томата (Solanum lycopersicum) сорта Micro-Tom, табака (Nicotiana tabacum) сорта Havana линии SR1 дикого типа и рапса (Brassica napus) сортов Риф и Ярило;
2. Трансформация растений при помощи A.tumefaciens штамма AGL0 и A.rhizogenes штаммов А4 и 15834;
3. ПЦР-анализ полученных линий бородатых корней;
4. Экстракция и определение концентрации антоциановых пигментов в полученных линиях бородатых корней методом pH- дифференциальной спектрофотометрии;
5. Поиск генов-мишеней для модификации pTC223 и трансформации растений из семейства капустных (Brassicaceae);
6. Разработка методических рекомендаций по применению материалов ВКР в школьном курсе «Биология».
Практическая значимость. Появление антоциановой окраски различных частей растения может служить визуальным маркерным признаком успешной модификации растительного генома, а также повышает стрессоустойчивость самого растения, его декоративную и пищевую ценность в контексте профилактического питания.
Апробация. По материалам дипломной работы были опубликованы две научные работы в рамках ежегодной конференции «Вавиловские чтения» 2018 г. в БГПУ им. Акмуллы (Сухарева А.С., Михайлова Е.В., Кулуев Б.Р. Роль антоциановых пигментов в растительных и животных организмах// Вавиловские чтения - 2018. - С. 67-76. [РИНЦ]) и международной научной конференции «Растения и микроорганизмы: биотехнология будущего» PLAMIC2018 в ИБГ УФИЦ РАН (Mikhaylova E.V., Kuluev B.R., Sukhareva A.S., Chemeris A.V. Prospects for genome editing in Brassicaceae // Plants and microbes: the future of biotechnology: abstract book International Scientific
Выпускная квалификационная работа выполнена в лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов Института биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук.
✅ Заключение
1. CRISPR-плазмида pTC223 была опробована для трансформации генома томата (сорта Micro-Tom), табака (сорта Havana линии SR1 дикого типа) и рапса (сортов Риф и Ярило).
2. При помощи A.tumefaciens штамма AGL0 было получено 2 каллусные линии томатов и 10 - табаков in vitro, а также инокулировано in planta 89 цветков и 20 плодов томата.
3. При помощи A.rhizogenes штамма А4 была получена 1 линия бородатых корней томата и 9 линий табака. При помощи штамма 15834 получено 9 линий бородатых корней томата и 19 линий табака.
4. ПЦР-анализ образцов ДНК из 10 линий бородатых корней томатов подтвердил событие трансформации в 9 образцах, причем, ни в одном образце не обнаружена контаминация A.rhizogenes.
5. ПЦР-анализ образцов ДНК из 22 линий бородатых корней табаков подтвердил событие трансформации в 21 образце. Из них, в 5 образцах обнаружена контаминация A.rhizogenes.
6. Методом pH-дифференциальной спектрофотометрии было выявлено наличие антоциановых пигментов в трех линиях бородатых корней табака и определена их массовая концентрация: линия 6 - 91,8443 г/100г; линия 16 - 5,0097 г/100г; линия 15 - 4,1803 г/100г.
7. В геноме растений из семейства Brassicaceae не было обнаружено гомологичных гидРНК из pTC223 последовательностей, следовательно, требуется поиск генов-мишеней (предпочтительно регуляторных областей генома), участвующих в биосинтезе антоцианов для подбора гидРНК. Таковым может стать ген PAP1.
8. Разработан комплекс методических рекомендаций по применению материала данной выпускной квалификационной работы в