ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Основные биологически активные вещества растений
в условиях in vivo и in vitro 10
1.1.1. Алкалоиды и их основные функции 11
1.1.2. Изопреноиды и их основные функции 12
1.1.3. Эфирные масла и их основные функции 12
1.1.4. Фенольные соединения и их основные функции 13
1.1.5. Дубильные вещества и их основные функции 14
1.1.6. Кумарины и их основные функции 14
1.1.7. Флавоноиды и их основные функции 15
1.2. Растительные экстракты и способы их получения 15
1.3. Биологическая и хозяйственная характеристики растений
семейства Lamiaceae 17
1.3.1. Биологическая и хозяйственная характеристика Шалфея
лекарственного (Sal-via officinalis L.) 18
1.3.2. Биологическая и хозяйственная характеристика шалфея
лугового (Salvia pratensis L.) 19
1.3.3. Биологическая и хозяйственная характеристика иссопа
лекарственного (Hyssopus officinalis L.) 20
1.3.4. Биологическая и хозяйственная характеристика иссопа
мелового (Hyssopus cretaceus Dubj.) 22
1.3.5. Биологическая и хозяйственная характеристика мяты
длиннолистной (Mentha longifolia (L.) Huds.) 24
1.3.6. Биологическая и хозяйственная характеристика пахучки
1.4. Теоретические основы культивирования клеток и тканей
растительных объектов в условиях in vitro 27
1.4.1. Биотехнология микроклонального размножения растений
in vitro 29
1.4.2. Культивирование каллусных тканей растений
in vitro 30
1.5. История развития методов культуры клеток и тканей
высших растений в условиях in vitro 32
1.6. Оснащение лаборатории для работ с культурой клеток и
тканей в условиях in vitro 35
1.7. Питательные среды для культивирования клеток и тканей
растений в условиях in vitro 36
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
2.1. Материалы исследования 38
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Сбор, и подготовка растительного сырья к хранению 39
2.2.2. Приготовление питательных сред 40
2.2.3. Создание асептических условий в лаборатории 42
2.2.4. Подбор оптимальных стерилизующих агентов для
растительного материала 43
2.2.5. Получение и культивирование стерильных проростков 44
2.2.6. Получение и культивирование каллусных культур 44
2.2.7. Приготовление растительных экстрактов 45
2.2.8. Приготовление суспензии микрооранизмов 46
2.2.9. Определение антимикробных свойств растительных
экстрактов 47
2.2.10. Статистическая обработка полученных данных 48
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
3.1. Определение антимикробной активности растительных
экстрактов, полученных из интактных растений 49
3.2. Подбор оптимальных стерилизующих агентов для введения
растительных эксплантов в культуру in vitro 60
3.3. Подбор оптимального состава питательных сред для
култивирования растений в условиях in vitro 85
3.4. Получение каллусных культур 102
3.5. Определение антимикробной активности растительных
экстрактов, полученных из каллусных культур 108
ГЛАВА 4.ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 121
4.1. Введение в культуру in vitro некоторых представителей
семейства Lamiaceae 121
4.2. Антимикробная активность некоторых представителей
семейства Lamiaceae 123
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 125
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 127
ПРИЛОЖЕНИЯ 144
Мир растений обладает большим количеством биологически активных веществ, которые могут использоваться в различных отраслях промышленности. Данные биологически активные вещества являются вторичными метаболитами растений и занимают значительное место в жизни людей. В современном мире биологически активные вещества, полученные из растений, применяются для создания лекарственных препаратов, пищевых добавок, продукции косметологической и парфюмерной отрасли, сельскохозяйственных средств (Цыренов, 2003; Саакян и др., 2008).
Некоторые биологически активные вещества растений обладают антимикробными свойствами, что делает возможным использование растительных экстрактов и вытяжек против многих болезней человека. В настоящее время такое использование растительных биологически активных веществ является актуальным, так как многие патогенные микроорганизмы приобретают высокую резистентность к антибиотикам (Юткина, Кувакова, 2013). Кроме этого известно применение растительных экстрактов для защиты растений (Никитина и др., 2007).
Биологические активные вещества, применяемые человеком, синтезируются многими растениями. Для их синтеза используют более 300 видов растений, из которых только 60 видов выращиваются целенаправленно, остальные виды используют как дикорастущее сырье. Обеспечить потребности современного общества в биологически активных веществах за счет сбора и переработки дикорастущих растений, многие из которых являются уникальными и занесены в Красные книги Российской Федерации и субъектов Российской Федерации, невозможно. Это связано с проблемой ограниченности природных ресурсов, проблемой малого количества биологически активных веществ в самих растениях и проблемой отсутствия технологии размножения in vivo некоторых видов (Verpoorte, 2002). Все виды растений, которые применяются в качестве источников биологически активных веществ, находятся в потенциальной опасности, как возможные кандидаты на включение в список Красной книги (Zschocke, 2000).
Альтернативным вариантом синтеза экономически ценных биологически активных веществ является культура растительных клеток и тканей и каллусные культуры растений, которые, как и клетки интактного растения, синтезируют биологически активные вещества (Юрин, 2002; Mulabagal, 2004; Чмелева и др., 2011). Данный метод дает возможность создать дополнительную сырьевую базу для получения ценных метаболитов растений вне зависимости от места произрастания растительных видов и сезона года и позволяет использовать их в разнообразных отраслях промышленности (Гарей - Матроссян, 2016).
Учитывая непрерывное уменьшение запасов дикорастущих растений, становится очевидным необходимость замены дикорастущего сырья на гарантированно получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток, которая содержит необходимые соединения в достаточном количестве (Гарей-Матроссян, 2016).
В связи с вышесказанным нами была выбрана следующая цель исследования: определить антимикробную активность некоторых представителей семейства Lamiaceae флоры Белгородской области в условиях in vivo (интактные растения) и in vitro (каллусные культуры).
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. определить антимикробную активность шалфея лугового (Sal-via pratensis L.), шалфея лекарственного (Sal-via officinalis L.), пахучки обыкновенной (Clinopodium vulgare L.), иссопа лекарственного (Hyssopus officinalis L.), иссопа мелового (Hyssopus cretaceus Dubj.) и мяты длиннолистной (Mentha longifolia (L.) Huds.) в условиях in vivo (интактных растений) на грамотрицательные бактерии (Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers) и грамположительные бактерии (Staphylococcus aureus Rosenbach);
2. определить эффективные стерилизующие агенты, их концентрацию и время воздействия для получения ассептического растительного материала для дальнейшего введения в культуру in vitro и получения каллусных культур;
3. установить оптимальный состав питательных сред для культивирования растительного материала и получения каллусных тканей из эксплантов;
4. провести микроклональное размножение и получить мини-растения
шалфея лугового (Salvia pratensis L.), пахучки обыкновенной (Clinopodium vulgare L.), иссопа лекарственного (Hyssopus officinalis L.) и мяты длиннолистной (Mentha longifolia (L.) Huds.) и каллусные культуры шалфея лугового (Salvia pratensis L.), шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), пахучки обыкновенной (Clinopodium vulgare L.), иссопа лекарственного (Hyssopus officinalis L.), иссопа мелового (Hyssopus cretaceus Dubj.) и мяты длиннолистной (Mentha longifolia (L.) Huds.);
5. определить антимикробную активность каллусных культур
исследуемых видов растений в условиях in vitro на грамотрицательные бактерии (Escherichia coli) и грамположительные бактерии (Staphylococcus aureus).
В качестве объекта исследования были выбраны растительные экспланты видов флоры Белгородской области: шалфея лугового (Salvia pratensis L.), шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), пахучки обыкновенной (Clinopodium vulgare L.), иссопа лекарственного (Hyssopus officinalis L.), иссопа мелового (Hyssopus cretaceus Dubj.) и мяты длиннолистной (Mentha longifolia (L.) Huds.), а также грамотрицательные бактерии вида E. coliи грамположительные бактерии вида S. aureus.
Предмет исследования - антимикробная активность растительных экстрактов интактных растений и каллусных культур вышеуказанных видов на грамотрицательные и грамположительные бактерии.
Научная новизна исследований заключается в том, что впервые исследуются антимикробные свойства растительных экстрактов из сырья флоры Белгородской области интактных растений и растений, полученный в условиях in vitro (в пробирке), на бактерии видов E. coliи 5. aureus;впервые разработаны условия получения изолированных культур исследуемых видов в условиях in vitro, подобран состав питательных сред для их выращивания; впервые получены изолированные культуры исследуемых видов в условиях in vitro.
Результаты настоящих исследований имеют практическую значимость, которая отражается в использовании исследуемого растительного сырья в различных отраслях промышленности, таких как фармацевтическое производство, пищевая и химическая промышленность, косметология и парфюмерия. Кроме этого, появляется возможность использования клеточных культур растений исследуемых видов вместо применения их дикорастущей части, что сохраняет их популяции в природе. Полученные каллусные культуры представляют непосредственный практический интерес как потенциальный источник ценных физиологически активных веществ и могут быть использованы в промышленных маштабах для массового выращивания.
Магистерская диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы по теме исследования, характеристики объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка используемой литературы и приложений. Список использованных источников состоит из 116 отечественных источников и 21 иностранного. В работу включены 154 рисунка, 30 таблиц, работа содержит 1 приложение.
Работа по введению в культуру in vitro была проведена в лаборатории «Инновационных методов исследования растительных объектов» кафедры биотехнологии и микробиологии НИУ «БелГУ»; работа по определению антимикробных свойств интактных растений и каллусных культур исследуемых видов была проведена в лаборатории «Биотехнологии и микробиологии» кафедры биотехнологии и микробиологии НИУ «БелГУ».
Выражаем благодарность М.Т. Петросян за возможность стажировки в Ереванском государственном университете по культуре клеток и тканей in vitro; В.Н. Скворцову и А.А. Присному за предоставленную возможность работы с культурами микроорганизмов (E. coliи N. aureus);Э.А. Снегину за рекомендации по подбору статистических критериев обработки полученных данных; А.А. Сиротину за консультации в области микробиологии; И.В. Батлуцкой за предоставленную возможность выполнения магистерской диссертации на кафедре биотехнологии и микробиологии и моему научному руководителю Е.В. Масловой за оказанную помощь в выполнении магистерской диссертации.
На сегодняшний день вопросы лечения заболеваний природными антимикробными препаратами, представленными растительными вытяжками и экстрактами, приобретают востребованность, так как они имеют широкий спектр действия, не обладают токсичностью, не вызывают аллергические реакции, не оказывают раздражающего действия (Хаджиева и др., 2010).
Получить в большом количестве биологически активные вещества, обладающие антимикробными свойствами, позволяет культура клеток и тканей in vitro. Культура клеток и тканей позволяет получать БАВ без извлечения дикорастущего сырья из природных популяций, тем самым появляется возможность сохранения природных популяций растений. Этот метод также позволяет получать экологически чистое сырье для различных отраслей промышленности, поскольку каллусная ткань выращивается в изолированой среде без воздействия антропогенных факторов (Буркова и др., 2014).
В результате исследований был дополнен созданный нами ранее генетический банк редких, исчезающих и лекарственных растений лаборатории «Инновационных методов исследования растительных объектов» культурами шалфея лугового (Sal-via pratensis L.), пахучки обыкновенной (Clinopodium vulgare L.), иссопа лекарственного (Hyssopus officinalis L.), мяты длиннолистной (Mentha longifolia (L.) Huds.), шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), иссопа лекарственного (Hyssopus officinalis L.). Это позволило исследовать их антибмикробные свойства.
Полученные результаты исследования позволяют сделать следующие выводы:
1. Установлена умеренная и слабая антимикробная активность исследуемых видов растений в условиях in vivo (интактных растений) на грамотрицательные бактерии (Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers) и грамположительные бактерии (Staphylococcus aureus Rosenbach). Определено, что наибольшим антимикробным действием из изучаемых видов обладает экстракт интактного растения C. vulgare.
2. Установлены эффективные стерилизующие агенты для получения асептических и жизнеспособных эксплантов и эксплантов с индукцией каллусогенеза. Определены их оптимальная концентрация и время воздействия. Для большинства исследуемых видов оптимальным режимом является воздействие стерилизующего агента в течение 10 минут, исключение составляет вид H. cretaceous.
3. Установлены оптимальные составы питательных сред для культивирования мини-растений in vitro и получения каллусных культур из эксплантов;
4. Получены мини-растения S. pratensis, C. vulgare, H. officinalisи M. longifoliaи каллусные культуры S. pratensis, S. officinalis, C. vulgare, H. officinalis, H. cretaceusи M. longifolia.
5. Установлена сильная, умеренная и слабая антибактериальная активность каллусных культур исследуемых видов (in vitro) на грамотрицательные бактерии (E. coli)и грамположительные бактерии (S. aureus).Определено, что наибольшей антибактериальной активностью из изучаемых видов обладает каллусная ткань вида H. cretaceus.
Таким образом, в ходе исследований определена антимикробная активность некоторых представителей семейства Lamiaceae флоры Белгородской области в условиях in vivo (интактные растения) и in vitro (каллусные культуры), проведен сравнительный анализ этих данных. Показана более сильная антимикробная активность каллусных тканей (in vitro) по сравнению с интактными растениями (in vivo) всех исследуемых видов, кроме C. vulgare.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
