Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
ℹ️Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Альтернативная оксидаза как компонент электрон-транспортной цепи митохондрии 7
1.2. Характеристика альтернативных оксидаз (АОХ) высших растений 7
1.2.1. Структура и регуляция транскрипции АОХ-генов 7
1.2.2. Структура и механизмы регуляции активности АОХ белка 12
1.2.3. Функции АОХ 17
1.2.3.1. Роль АОХ в контроле метаболического гомеостаза 17
1.2.3.2. Роль АОХ при адаптации к стрессовым воздействиям 18
1.3. Характеристика альтернативных оксидаз (АОХ) Chlamydomonas
reinhardtii 21
1.3.1. Структура и регуляция транскрипции АОХ-генов 21
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 26
2.1. Объекты исследования 26
2.2. Условия культивирования 26
2.3. Количественный анализ экспрессии генов 28
2.3.1. Выделение тотальной РНК 28
2.3.2. Синтез одноцепочечной кДНК 29
2.3.3. ПЦР в режиме реального времени 29
2.4. Вестерн-блоттинг 31
2.5. Получение штамма со сниженным уровнем мРНК CRR1 32
2.5.1. Конструирование последовательностей олигонуклеотидов, специфичных к СRR1 32
2.5.2. Клонирование двухцепочечной ДНК для экспрессии искусственных
микро РНК 33
2.5.3. Отбор amiRNA-клонов, содержащих вставку в ориентации, необходимой для экспрессии 34
2.5.4. Трансформация C. reinhardtii 36
2.6. Измерение дыхания клеток 37
2.7. Измерение активных форм кислорода (АФК) 37
2.8. Анализ активности каталазы 38
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ 39
3.1. Действие кадмия на синтез и активность альтернативной оксидазы
АОХ1 39
3.1.1. Действие кадмия на транскрипцию гена АОХ1 39
3.1.2. Действие кадмия на уровни белка АОХ1 41
3.1.3. Действие кадмия на АОХ-зависимое дыхание 42
3.1.4. Действие кадмия на концентрацию внутриклеточных АФК и активность каталазы 43
3.2. Действие стрессоров на экспрессию гена АОХ2 45
3.2.1. Действие аноксии на транскрипцию генаAOX2 45
3.2.2. Роль транскрипционного фактора CRR1 в контроле транскрипции гена АОХ2 47
3.2.3. Действие дефицита меди на транскрипцию гена АОХ2 49
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 51
4.1 Синтез и функционирование альтернативной оксидазы АОХ1 в условиях стрессового воздействия 51
4.2 Регуляция экспрессии АОХ2 в стрессовых условиях 52
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 54
ВЫВОДЫ 56
БЛАГОДАРНОСТИ 57
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 58
📖 Введение
Фотосинтезирующие эукариотические микроорганизмы быстро и эффективно адаптируются к изменениям в окружающей среде. При этом, наличие у этой группы микроорганизмов митохондрий и хлоропластов предполагает необходимость координированного функционирования разных компартментов клеток и наличие компартмент-специфичных механизмов, обеспечивающих эффективную адаптацию к неблагоприятным факторам. Следует подчеркнуть, что в литературе практически не обсуждается роль митохондрий в процессах адаптации и тех компонентов митохондрий, которые обеспечивают защитно-адаптивные реакции фототрофных эукариотических микроорганизмов в ответ на разные по природе стрессоры. Последнее обстоятельство ограничивает существующие представления как о механизмах регуляции стрессовых ответов, так и свойствах белков, функционирующих в митохондриях. В связи с этим возникает необходимость изучения митохондриальных белков, которые выполняли бы функцию интеграции метаболического состояния клетки с действием внешних стрессоров.
Один из механизмов клеточной защиты связан с функционированием альтернативных оксидаз (ЛОХ), локализованных в митохондриях. Хотя АОХ выявлены у эукариотических микроорганизмов, растений и грибов, изучались они главным образом у высших растений (Vanlerberghe et al., 2013). У высших растений существует два типа генов, кодирующих альтернативные оксидазы: AOX1,которые найдены у всех проанализированных представителей, и AOX2,которые, по-видимому, ограничены только двудольными растениями (Polidoros et al., 2009). Альтернативные оксидазы растений представлены, как правило, многими белками. Так у Arabidopsisих пять: AOX1a, AOX1b, AOX1c, AOX1d и AOX2. Столь многокомпонентная организация AOX, безусловно, затрудняет анализ свойств каждого отдельного представителя. Предполагают, что у высших растений альтернативные оксидазы могут действовать как центральные регуляторы роста и развития, а также как интеграторы сигналов стрессовых условий (Clifton et al., 2006; Vanlerberghe, 2013). В геноме модельного микроорганизма Chlamydomonas reinhardtiiвыявлено два гена, AOX1и AOX2,которые локализованы в разных хромосомах (хромосомы 9 и 3, соответственно). Ген AOX1 C. reinhardtii расположен в генетическом кластере, участвующем в ассимиляции нитратов (Gerin et. al, 2010, Molen et. al., 2006, Quesada et. al., 1993). Показано, что транскрипция AOX1 C. reinhardtiиндуцируется нитратом и репрессируется аммонием, и AOX1-белок вовлечен в контроль наиболее важных путей метаболизма микроорганизма (Gdrin et al., 2010).
Особенно следует подчеркнуть, что подобная регуляция альтернативной оксидазы нитратом и аммонием уникальна для C. reinhardtii,а для высших растений характерна противоположная зависимость: активация аммонием и репрессия нитратом. Вместе с тем, роль AOXl-белка в стрессовых условиях совершенно не ясна. Сотрудниками лаборатории впервые показана индукция AOX1и возрастание доли альтернативного дыхания в условиях теплового стресса (Zalutskaya, Lapina, Ermilova, 2015). Однако неизвестно, какова роль AOX1 в условиях гипертермии, и вовлечена ли эта альтернативная оксидаза у C. reinhardtiiв защитно-адаптивные ответы микроорганизма на другие стрессовые воздействия. Более ранние исследования некоторых авторов по анализу транскрипции AOX1в условиях незначительного снижения температуры (до 18°C) и окислительного стресса были проведены с использованием методов, которые не позволили корректно проанализировать регуляцию гена (Molen et al., 2006). Регуляция и роль второй
альтернативной оксидазы микроорганизма, АОХ2, не изучалась совсем. В связи с этим возникает вопрос о возможном разграничении функций между продуктами генов AOX1и AOX2в разных условиях и возможной роли ХОХ C. reinhardtiiв качестве интегратора стрессовых сигналов.
Цель работы состояла в изучении регуляции синтеза и активности альтернативных оксидаз Chlamydomonas reinhardtiiв стрессовых условиях.
В связи с этим были сформулированны следующие задачи исследования:
1. Охарактеризовать стрессовые условия, которые обуславливают увеличение транскрипции АОХ-генов и приводят к возрастанию АОХ-зависимого дыхания в клетках C. reinhardtii.
2. Выявить регулятор(ы) транскрипции, которые могут контролировать экспрессию АОХ-генов в стрессовых условиях.
3. Оценить, насколько различны условия, в которых клетки C. reinhardtii синтезируют две альтернативные оксидазы.
4. Экспериментально проверить существующую парадигму о том, что представители субсемейства АОХ2 коститутивно экспрессируются и не индуцируются в срессовых условиях.
✅ Заключение
Анализ регуляции альтернативных оксидаз C. reinhardtiiв стрессовых условиях позволил прийти к следующему заключению.
При действии на клетки C. reinhardtiiтоксичных для них концентраций кадмия происходило увеличение не только уровней транскрипции AOX1гена и уровней белка АОХ1, но и возрастала доля альтернативного дыхания, как защитного ответа на увеличение активных форм кислорода (Zalutskaya et al. (2016) Env Exp Bot). Кроме того, нами впервые установлена индукция гена AOX1при адаптации клеток к росту в темноте, и доказано, что сигналы, опосредуемые темнотой, функционируют в аддитивной манере с сигналами, индуцируемыми действием кадмия. Полученные данные позволяют расширить наши представления о стрессовых условиях, которые обуславливают увеличение АОХ- зависимого дыхания и приводят к возрастанию уровней альтернативной оксидазы АОХ1 в клетках C. reinhardtii.
Впервые показана индукция гена, кодирующего альтернативную оксидазу из второго подсемейства - AOX2, в условиях гипоксии и дефицита меди; контроль транскрипции находится под контролем транскрипционного фактора CRR1 (Ostroukhova et al. (2017) European Journal of Protistology). Полученные данные позволяют пересмотреть существующую ранее парадигму о белках семейства AOX2, как конститутивно синтезируемых и не вовлеченных в ответы на действие стрессоров. По нашему мнению, альтернативные оксидазы могут представлять собой один из ключевых компонентов ответов микроорганизма на стрессовые воздействия наряду с охарактеризованной ранее ролью АОХ1 в адаптации клеток к росту на нитрате в качестве источника азота (Рис. 22). Процессы, которые контролируются альтернативными оксидазами C. reinhardtiiпри стрессовых воздействиях, могут быть шире, чем известно в настоящее время. На основе анализа штаммов со сниженными уровнями АОХ1 и АОХ2 в дальнейшей работе предполагается проверить гипотезу о том, что процессы, которые контролируются альтернативными оксидазами C. reinhardtiiпри стрессовых воздействиях, могут быть шире, чем известно в настоящее время.