Перечень условных обозначений 4
Введение
Актуальность 5
Цель и задачи исследования 6
Научная новизна работы 7
Практическая значимость работы 7
Глава 1. Литературный обзор
1.1. Этиология и патогенез воспалительных заболеваний пародонта 8
1.2. Микробиота полости рта и воспалительные заболевания
пародонта 18
1.2.1. Нормальная микробиота полости рта 18
1.2.2. Микробиота пародонтального кармана при хроническом
генерализованном пародонтите 19
1.2.3. Вирулентные свойства пародонтопатогенов 22
1.3. Антибиотики в комплексном лечении заболеваний пародонта 32
1.4. Механизмы устойчивости к антибиотикам 35
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Клиническая характеристика пациентов 39
2.2. Оценка стоматологического статуса пациентов 39
2.3. Микробиологические и генетические методы исследования
2.3.1. Забор материала 45
2.3.2. Культуральные среды и условия роста 45
2.3.3. Выделение чистой культуры 45
2.3.4. Выделение тотальной ДНК из исходного биологического
материала 46
2.3.5. Конструирование олигонуклеотидных праймеров 46
2.3.6. Полимеразная цепная реакция 47
2.3.7. Электрофорез и выделение ДНК из агарозного геля,
3.1. Результаты клинических исследований 51
3.2. Результаты рентгенологического исследования 54
3.3. Результаты микробиологических исследований
3.3.1. Выделение факультативных анаэробов 54
3.3.2. ПЦР-скрининг на пародонтопатогены 57
3.3.3. Идентификация выделенных чистых культур 59
3.4. Антибиотикочувствительность идентифицированных чистых
культур 66
Глава 4. Заключение и выводы
4.1. Заключение 69
4.2. Выводы 71
4.3. Практические рекомендации 72
Список литературы 73
Приложения 77
Воспалительные заболевания пародонта (ВЗП) относятся к наиболее распространенной стоматологической патологии.
В мире, согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ, 1997), более 80% населения подвержено ВЗП, которые приводят к потере зубов, появлению в полости рта очагов хронической инфекции, снижению реактивности организма, микробной сенсибилизации, развитию аллергических состояний (Маланьин И.В., Емелина Г.В., Иванов П.В., 2010).
В связи с огромным количеством накопленной информации о роли разных видов микроорганизмов в развитии ВЗП, ВОЗ (1994 - 1995) рекомендовала среди нормальной микробиоты полости рта с анаэробным типом дыхания выделять так называемые «пародоптопатогенные» виды, отличающиеся от других видов микроорганизмов высокими адгезивными, инвазивными и токсическими свойствами по отношению к тканям пародонта (Царев В.Н. с соавт., 1996; Царев В.Н., 2004).
К «пародонтопатогенным» видам микроорганизмов относят: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Prevotella intermedia, Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum, Actinobacillus actinomycetemcomitansи др. (Елисеева А.Ф., 2014).
Следовательно, это определяет ряд задач, которые должны быть направлены на выявление и идентификацию пародонтопатогенов, и новые подходы к лечению ВЗП.
Несмотря на усовершенствование методов микробиологической диагностики - использование анаэробной техники культивирования, газовой хроматографии, иммунохимического анализа, проблема этиологической диагностики и лечения ВЗП остается одной из основных в стоматологии.
На сегодняшний день существует необходимость разрабатывать новые методы лечения с дифференцированным применением лекарственных средств, так как имеются трудности в подборе эффективного антибактериального препарата (Царев В.Н., Ушаков Р.В., 2006). Это связано с тем, что интенсивное и неконтролируемое применение химиопрепаратов привело к формированию и распространению множества штаммов микроорганизмов резистентных к антибактериальному лечению. Поэтому в настоящее время для осуществления и совершенствования комплексного персонализированного лечения ВЗП актуальным является определение чувствительности микробиоты пародонтальных карманов к антибиотикам.
Исследование микробиоты пародонтальных карманов позволяет диагностировать ВЗП, прогнозировать дальнейшее развитие заболевания, контролировать эффективность лечебных мероприятий и подбирать наиболее эффективную антибактериальную терапию.
Таким образом, оценка антибиотикочувствительности микробиоты пародонтальных карманов с помощью микробиологических методов исследования позволит подобрать наиболее эффективные антибактериальные препараты для лечения ВЗП и составить рекомендации по их использованию.
Цель исследования:
Определение антибиотикочувствительности микробиоты пародонтальных карманов у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом (ХГП) легкой степени тяжести.
Задачи исследования:
1. Изучить количественный и качественный состав микробиоты пародонтальных карманов у пациентов с ХГП легкой степени тяжести;
2. Провести анализ антибиотикочувствительности микробиоты пародонтальных карманов у пациентов с ХГП легкой степени тяжести;
3. На основании клинико-микробиологических данных сформулировать рекомендации по применению антибактериальных препаратов у пациентов с ХГП легкой степени тяжести.
Научная новизна работы:
Проведена оценка антибиотикочувствительности выделенных чистых культур микробиоты пародонтальных карманов пациентов с ХГП легкой степени тяжести. С помощью масс-спектрометрии идентифицированы культуры - Streptococcus gordonii, Streptococcus anginosus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis, Neisseria perflava, Rothia mucilaginosa.Проведено секвенирование и идентифицированы культуры - Rothia mucilaginosa, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis. Проведен ПЦР - скрининг на пародонтопатогены и определены Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia.
Практическая значимость работы:
Использование антибиотиков из группы бета-лактамов, макролидов и фторхинолонов, обладающих выраженной активностью в отношении наиболее часто встречающихся видов бактерий, вызывающих ВЗП, позволяет рекомендовать их в качестве эффективных средств комбинированного лечения ХГП легкой степени тяжести.
Целью настоящего исследования являлась оценка антибиотикочувствительности микробиоты пародонтальных карманов у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом (ХГП) легкой степени тяжести.
В исследовании приняли участие 7 пациентов в возрасте от 35 до 54 лет с ХГП легкой степени тяжести без тяжелой сопутствующей патологии. Были собраны жалобы пациентов и анамнез; проведены клинические (индексная оценка состояния тканей пародонта) и рентгенологические исследования; микробиологические и генетические исследования (культивирвание микроорганизмов, масс - спектрометрия, постановка ПЦР и секвенирование). В ходе исследования была изучена чувствительность идентифицированных чистых культур к антибиотикам разных групп (бета- лактамам, аминогликозидам, полипептидам, фторхинолонам, полимиксинам и макролидам).
Анализ результатов индексной оценки гигиены и состояния тканей пародонта показал, что все индексы соответствуют ХГП легкой степени тяжести и отражают тот факт, что развитие ХГП тесно связано с уровнем гигиены пациента, который у обследованных нами пациентов оказался неудовлетворительным. Наличие зубного налета и зубного камня несомненно является основополагающим фактором в развитии ВЗП. Воздействие пародонтопатогенов приводит к утрате пародонтального прикрепления и в последующем к образованию пародонтальных карманов, характеризующихся разрушением соединительного эпителия, который защищает пародонт от микробных метаболитов.
По результатам проведенного ПЦР - скрининга на пародонтопатогены у всех обследованных пациентов были выявлены Porphyromonas gingivalisи Tannerella forsythia,также у некоторых пациентов были выявлены Actinobacillus actinomycetemcomitansи Prevotella intermedia.
С помощью масс - спектрометрии проводили идентификацию выделенных чистых культур. Были идентифицированы факультативные анаэробы: Streptococcus gordonii, Streptococcus anginosus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis, Neisseriaperflava, Rothia mucilaginosa.
Был также произведен подсчет количества колониеобразующих единиц (КОЕ) факультативных анаэробов в исходном биологическом материале и составил 104- 105 КОЕ/мл. Можно предположить, что этой концентрации достаточно для возникновения и течения ХГП легкой степени тяжести.
При проведении секвенирования ДНК-фрагментов, кодирующих 16S рибосомальную РНК, были идентифицированы: Rothia mucilaginosa, Streptococcus mitisи Streptococcus oralis.
По полученным нами результатам антибиотикочувствительности можно сделать заключение, что все идентифицированные микроорганизмы чувствительны к Азитромицину (относительно новый препарат из группы макролидов на Российском рынке) и практически все микроорганизмы чувствительны к антибиотикам из группы бета-лактамов, кроме Streptococcus sanguinis, Neisseria perflavaи некоторых штаммов Rothia mucilaginosa.Также эти микроорганизмы устойчивы к препарату из группы фторхинолонов Ципрофлоксацину, к которому в свою очередь чувствительны остальные идентифицированные нами микроорганизмы. Наибольшую устойчивость микроорганизмы проявили к полимиксинам, аминогликозидам и полипептидам.
Эти данные согласуются с данными проведенных исследований по данной теме: «Анализ чувствительности микробных ассоциаций, выделенных у пациентов с пародонтитом, к антибиотикам» (Володина Е.В., Багдасарян В.А., 2014); «Дифференцированное применение антибиотиков в комплексном лечении хронического генерализованного пародонтита" (Галабуева А.И., 2005); "Эффективность комплексного лечения пародонтита с применением антибиотиков по результатам теста индивидуальной чувствительности микрофлоры" (Шарапудинова М.Г., 2009).
Все поставленные задачи исследования были выполнены и сделаны соответствующие выводы.
4.2. Выводы
1. Изучение состава микробиоты пародонтальных карманов у пациентов с ХГП легкой степени тяжести показало преобладание факультативных анаэробов рода Streptococcusв концентрации 104-105 КОЕ/мл.
2. ПЦР-скрининг на выявление пародонтопатогенов показал, что уже при ХГП легкой степени тяжести у всех пациентов в пародонтальных карманах обнаруживаются Porphyromonas gingivalisи Tannerella forsythia. У 86 % пациентов с ХГП легкой степени тяжести выявлены Actinobacillus actinomycetemcomitans,у 71% - Prevotella intermedia.
3. Выделенные из пародонтальных карманов факультативные анаэробы высоко чувствительны к бета-лактамам, макролидам и фторхинолонам. Выявлена устойчивость большинства выделенных микроорганизмов к аминогликозидам, полимиксинам, полипетидам.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
