Введение 4
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1. Характеристика рода Enterococcus 6
1.2. Определение пробиотиков 6
1.3. Использование штаммов рода Enterococcusв качестве пробиотиков 7
1.4. Патогенность Enterococcus spp 8
1.4.1 Факторы вирулентности Enterococcus spp 8
1.5. Приобретенная антибиотикорезистентность Enterococcus spp 10
1.5.1 Роль ARE, как возбудителей внутрибольничных инфекций 11
1.6. Характеристика бактериоцинов 13
1.6.1 Классификация бактериоцинов 14
1.6.1 Генетика бактериоцинов на примере entA 15
1.6.2 Синтез бактериоцинов 16
1.6.3 Бактериоцины энтерококков 17
Глава 2. Материалы и методы 18
2.1. Объекты исследования 18
2.2. Условия культивирования штаммов Enterococcus spp 18
2.3. Выделение ДНК 18
2.4. Определение концентрации ДНК 18
2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 19
2.6. Линейный электрофорез в агарозном геле 20
2.7. Измерение антимикробной активности методом диффузии в агар 20
2.8. Определение природы антимикробной активности 21
2.9. Создание рекомбинантной конструкции для последующего инсерционного мутагенеза 21
2.9.1 Выделение плазмиды 22
2.9.2 Создание рекомбинантной конструкции 22
2.9.3 Трансформация E. coli 22
Глава 3. Результаты исследования и обсуждение 24
3.1. Описание гена lcbE 24
3.1.1 Распространенность гена lcbEи характеристика участка ДНК, содержащего данный ген ...24
3.2. Распространенность генов, кодирующих бактериоцины 27
3.3. Антимикробная активность штаммов Enterococcus faecium 29
3.4. Взаимосвязь наличия lcbEи антимикробной активности 30
3.5. Природа антимикробной активности 31
3.6. Взаимосвязь антимикробной активности и наличия бактериоцинов 32
3.7. Создание рекомбинантной конструкции 33
Выводы 36
Список литературы 37
Бактериоцины - это большое семейство секретируемых некоторыми бактериями пептидов, обладающих антимикробной активностью против близкородственных видов и родов бактерий [70]. В настоящий момент является актуальным поиск и изучение новых антимикробных веществ, в частности бактериоцинов, так как их возможно использовать в качестве консервирующих веществ в пищевой промышленности для предотвращения порчи изготавливаемых продуктов сапрофитными микроорганизмами.
Представляют интерес не только сами бактериоцины, но и продуцирующие их бактериальные штаммы, которые так же могут быть использованы в пищевой и фармацевтической промышленности в составе стартовых культур и пробиотических препаратов. Способность проявлять антагонистическую активность к патогенным бактериям является одним из определяющих свойств при выборе пробиотических штаммов [66].
Бактериоцины энтерококков в настоящее время исследованы довольно подробно, в особенности такие пептиды как EntA, EntB, EntXa/p, L50A/B [6, 11, 14, 15, 37]. При исследовании полногеномного сиквенса штамма Enterococcus faecium L-3, который входит в состав пробиотического препарата «Ламинолакт» были обнаружены гены, кодирующие структурные единицы энтероцинов EntA, EntB, EntXa и EntXp, а также гены, отвечающие за регуляцию синтеза этих бактериоцинов [40].
Кроме того, в составе оперона, отвечающего за синтез энтероцина A, у этого штамма присутствует ген lcbE,который потенциально кодирует бактериоциноподобный пептид с неизвестными на данный момент функциями. По данным биоинформатического анализа, продукт гена lcbE предположительно является низкомолекулярным пептидом, имеющим лидерную последовательность, заканчивающуюся двумя глицинами, характерную для бактериоцинов второго класса.
Для изучения функции данного гена требуется методом инсерционного мутагенеза получить штамм Enterococcus faeciumс инактивированным геном lcbE.Для этого необходимо создать рекомбинантный вектор для проведения инсерционного мутагенеза, а также подобрать подходящий для данной процедуры штамм E. faecium.Так как продуктом экспрессии данного гена предположительно является антимикробный пептид, то способность штаммов E.faeciumугнетать рост других бактерий может служить критерием сравнения при изучении фенотипических свойств мутантного и исходного штаммов.
В связи с этим была поставлена цель:
Охарактеризовать участок ДНК штаммов Enterococcus faecium,потенциально кодирующий бактериоцинподобный пептид LcbE.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Проанализировать коллекцию штаммов Enterococcus faeciumна наличие гена lcbE,и генов, кодирующих бактериоцины: entA, entB, EntXa/fi, entP.
2. Определить наличие и природу антимикробной активности коллекционных штаммов Enterococcus faecium.
3. Создать рекомбинантную конструкцию для инсерционного мутагенеза для выключения гена lcbE.
1. Подавляюще большинство исследованных клинических штаммов Enterococcus faeciumсодержат ген lcbEи гены бактериоцинов.
2. Структура и состав участка ДНК, включающего ген lcbE,отличаются у разных штаммов. Гены lcbEи entAне обязательно локализованы в пределах одного оперона.
3. Клинические штаммы Enterococcus faeciumпроявляют ингибирующую активность в отношении грамположительных индикаторных микроорганизмов. В ряде случаев антимикробная активность обусловлена продукцией термостабильных бактериоцинов.
